Spôsob hydrolýzy reťazca aminokyselín preproinzulínu

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Opisuje sa spôsob špecifickej hydrolýzy reťazca aminokyseliny preproinzulínov na zodpovedajúce intermediáty pomocou clostripainu a tieto intermediáty sa môžu prípadne previesť karboxypeptidázou B na zodpovedajúce inzulíny.

Text

Pozerať všetko

SLOVENSKÁ REPUBLIKA , 9, SK 279 686 Číslo prihlášky 2711-91 Dátum podania 03.09.91 (13) Dmh d°km° B Číslo prioritnej prihlášky P 40 zs 113.3 (51) 1 c s Dátum priority 05.09.90 C 971( 14/52 Krajina priority DEPRIEMYSELNEHO Dátum zverejnenia udelenia vo Vestníku 11.02.99SLOVENSKEJ REPUBLIKY Číslo PCT(73) Majiteľ patentu HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT, Frankfurt am Main, DE(72) Pôvodca vynálezu Dörschug Michael, Dr., Bochum, DE Koller Klaus-Peter, Dr., Bad Soden am Taunus, DE Marquardt Rüdiger, Dr., Frankfurt am Main, DE Meiwes Johannes, Dr., Hofheim am Taunus, DE(54) Názov vynálezu Spôsob hydrolýzy reťazca aminokyselín preproinzulínu(57) Anotácia Opisuje sa spôsob špecifickej hydrolýzy reťazca aminokyseliny preproinzulínov na zodpovedajúce intermev diáty pomocou clostripaínu a tieto íntennediáty sa môžu prípadnc previesť karboxypeptidázou B na zodpovedajúce inzulíny.Vynález sa týka spôsobu konverzie preproinzulínov na ínzulíny.Inzulíny pozostávajú z dvoch polypeptidových reťazcov , reťazca A, ktorý obsahuje 21 zvyškov aminokyselín a reťazca B s 30 zvyškami aminokyselín. A a B reťazce sú spolu spojene disulfidovými mostmi, pričom zvyšky cysteínu sú spolu spojené v polohe A 7 a B 7 ako aj A 20 a Bl 9. Tretí disulñdový mostík je medzi A 6 a A 11. Zvieracie a ľudské inzulíny sa tvoria v slinivke brušnej vo forme preproinzulínu. Ľudský preproinzulín pozostáva napríklad z prepeptidu s 24 zvyškami aminokyselín, na ne sa pripojuje proinzulín s 86 zvyškami aminokyselín s nasledujúcou konliguráciou prepeptid-B-arg-arg-C-lys-arg-A, pričom C je reťazec aminokyselín s 31 zvyškami. V priebehu exkrécie z Langerhansových ostrovčekov sa odštiepi prepeptid a vznikne proinzulín. Konečne sa C-reťazec štiepi proteolyticky a vznikne účinný ľudský inzulín.Gěnovo technicke metódy dovolia v zvyšujúcej sa miere exprimovať preproinzulíny v mikroorganizmoch (EP-A-347 781, EP-A-367 163). Odštíepenie preprosekvencií sa robí spravidla chemicky alebo enzymaticky (DE-P-3 440 988, EP-A-0264250). Známe enzymatickć metódy konverzie spočívajú na štiepeni trypsínom a karboxypeptidázou B (Kemmler W. et al. J. Biol. Chem., 246 (1971) 6786-6791, EP-A-l 95 691, EP-B-89007). Nedostatkom týchto metód je vznik veľkého množstva vedľajších produktov, ktoré sa dajú len ťažko oddeliť z reakčnćho roztoku. Hlavne pri konverzii ľudského preproinzulínu na ľudský inzulin (humánny inzulin, H 1) vznikajú väčšie množstvá des-thr(B 30)-humánneho inzulínu (des-thr(B 30)-Hl). Tento vedľajší produkt sa líši od HI len tým, že chýba koncová aminokyselina a dá sa veľmi ťažko oddeliť z reakčného roztoku.Na zníženie tvorby tohto vedľajšieho produktu sa môžu k štíepnej dávke pridávať určité ťažké kovy, predovšetkým nikel (EP-A-0264 250). Takéto vedenie reakcie nie je z hľadiska veľkovýroby na základe veľkého zaťaženia odpadovými vodami žiaduce. Je teda potrebné nájsť čo najšpecifiekejšiu a pre životné prostredie znesiteľnú konverziu preproinzulínov.Clostripain (clostriopeptidáza B, EC 3422.8) je enzým z filtrátu kultúry Clostridium histolyticum s molekulovou hmotnosťou asi 30 000 až 80 000, ktorý má tak proteolytickú aktivitu, ako aj aktivitu amidázy esterázy (Mitchell, W. M Harington, W. F. J. of Biol. Chem. 243 (18), 4683,4692, 1988). Vyznačuje sa veľkou špecifickosťou k väzbám arg-C. Tak sa v izolovanom reťazci B inzulínu arg-gly-väzba clostripainom 500 krát rýchlejšie odštiepi než väzba lysala a v glukagone len arg-arg, arg-ala a lys-tyr. Rýchlosť hydrolýzy pre tieto väzby je vo vzájomnom pomere l,l/7 1/300. (Labousse, B. Bull. Soc. Chim. Biol.,42,l 293,l 960). S prekvapením bolo teraz nájdené, že clostripain štiepi preproinzulín špecificky na terminálnom C za arginínom bez toho, aby u arginínu (B 22) prítomného za ním v reťazci B prišlo k štiepeniu reťazca aminokyselín,ktore by stálo za zmienku.Podstatou vynálezu je spôsob hydrolýzy reťazca aminokyselín preproinzulínu všeobecného vzorca (I),R znamená n aminokyselín, pričom nje celé číslo 0 alebo 1,R 2 je vodík alebo chemicky alebo enzyrnaticky odštiepiteľná alebo peptid s 2 až 30 zvyškami aminokyselín, R 3 je hydroxyskupina, amínokyselina alebo peptid s 2 až 10 aminokyselinami, X je L-arginín alebo peptid s 2 až 45 aminokyselinami, na ktorého terminálnom C a N je zvyšok L-arginínuY je geneticky kódovateľná aminokyselina, Z je geneticky kódovateľná aminokyselina, A 1 až A 20 alebo B 2 až B 29 je prirodzená alebo výmenou jedného alebo viacerých zvyškov aminokyselín zmenená sekvencia aminokyseliny ľudských alebo zvieracích inzulínov,spočívajúcí v tom, že sa preproinzulín hydrolyzuje v prítomnosti clostiipainu a prípadne sa karboxypeptidázou B prevedie na zodpovedajúci inzulin.Sekvencía aminokyseliny peptidov a proteínov sa na N-termínálnom konci označí. Proteázy hydrolyzujú peptidovú väzbu medzi aminokyselinami peptidov a proteínov. Clostripain hydrolyzuje peptidy alebo proteíny obsahujúce L-arginín špecifický za arginínom. Ako reakčné produkty hydrolýzy preproinzulínu vznikajú deriváty inzulínu alebo polypeptidy, ktoré majú na terminálnom C zvyšok arginínu alebo aminokyseliny.Pod pojmom prirodzené aminokyseliny sa rozumeju napríklad Gly, Ala, Ser. Thr., Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu,Gln, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro, Eyp, Trp, Arg, Lys, Hyl, Orn,Cit alebo His.Pod pojmom geneticky kódovateľná aminokyseliny sú napríklad Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu,Gln, Cys, Met, Arg, Lys, His, T yr, Phe, Trp, Pro alebo selenocysteín.Výhodné sú preproinzulíny všeobecného vzorca (I), V ktorom R je Phe, R 2 vodík, prirodzená aminokyselina alebo peptid s 2 až 30 prirodzenými aminokyselinami, ich tenninálne C končí L-arginínom, R 3 je hydroxyskupina, prirodzená aminokyselina alebo peptid s 2 až 10 prirodzenými aminokyselinami, X je L-arginín alebo C-reťazec ľudského alebo zvieracieho proínzulínu, Y je aminokyselína zo skupiny Thr, Ala alebo Ser, Z je aminokyselina zo skupiny Asn, Gln, Asp, Glu, Gly,Ser, Thr, Ala alebo Met, Al až A 20 alebo B 2 až 1329 je sekvencía aminokyseliny ľudských alebo zvieracích proinzulínov.Obzvlášť výhodné sú preproinzulíny všeobecného vzorca (l), V ktorom R 1 je Phe, R 2 vodík alebo peptid s 2 až 30 prirodzenými aminokyselinami, ktorý na terminálnom C končí L-argínom, R 3 je hydroxyskupina, prirodzená aminokyselina alebo peptid s 2 až 10 prirodzenými aminokyselinami, X je L-arginín alebo C-reťazec ľudského, bravčového alebo hovädzieho proinzulínu, Y je Thr, Z je Asn, Al až A 20 alebo B 2 až B 29 je sekvencia aminokyseliny ľudského, bravčového alebo hovädzieho inzulínu.Najvýhodnejšie sú inzulíny, ktoré už boli navrhnutév nemeckých patentových prihláškach P 39 19 852 a P 40 12 818.0. Napriklad InsuArg s nasledujúcou sekvencíou aminokyseliny NH 2-Asp Tl-ir Thr Val Ser Glu Pro Asp Pro Asn Ser Asn Gly Arg Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys AsnClostripain (EC 34.22.23) je extraceluláma tiolproleáza z clostridienu. Enzým je heterodimćr a nie je homologieký s inými známymi tiolproteázami. Enzým má mimoriadne vysokú špecifickosť k väzbám Arg-XXX, hlavne Arg-Pro. Táto sa dá charakterizovať molekulovou hmotnosťou pohybujúcou sa medzi 30 000 až 80 000 izoelekoickým bodom, pH 4,8 až 4,9. Ako aktivátor pôsobí napríklad cysteín, merkaptoetanol, ditiotreitol alebo ióny kalcia.V prítomnosti napríklad tozyl-lyzín-chlórmetylketónu,peroxidu vodika, EDTA, ce, cu , Cd 2, iónov albocitrátu dochádza k inhibícii clostripainu.Clostripain sa vyrába fermentáciou pomocou mikroorganizmov. Pri tomto spôsobe sa clostridion kultivuje až do rozmnoženia clostripainu V živnom prostredí. Vhodné je napríklad Clostridium hystolyticum, hlavne Clostridium histolyticum DSM 627. Vhodné sú ale aj mutanty a varianty uvedených mikroorganizmov, pokiaľ syntetizujú clostripain.Kultivácia sa robí anaeróbne buď samostatne alebo v zmesovej kultúre, napríklad submerzne v stojacej kultúre v neprítomnosti kyslíka alebo vo fermentátoroch, pripadne za zavádzania dusíka, vzácnych plynov alebo iných plynov,bez kyslíka. Fermentácia sa robí V rozmedzí teplôt asi 10 až 45 °C, výhodne asi 25 až 40 °C, hlavne potom pri 30 až 38 °C. Fermentácia sa robí v oblasti hodnôt pH medzi 5 až 8,5, výhodne medzi 5,5 až 8. Za týchto podmienok má kultivačná brečka všeobecne po l až 3 dňoch akumuláciu enzýmu, ktorá stojí za zmienku. Syntéza clostripainu spočíva v neskorej log-fáze a dosahuje svojho maxima V Stacionárnej fáze rastu. Produkcia enzýmu sa môže sledovať pomocou testu aktivity (Mitchell W., Meth. of Enzým., zv. 47Živný roztok použitý na výrobu clostripainu obsahuje 0,2 až 6 výhodne 0,5 až 3 , organických dusíkatých zlúčenín, ako aj anorganických solí. Ako organické dusíkaté zlúčeniny prichádzajú do úvahy aminokyseliny, peptóny, ďalej masové extrakty, mleté semená, napriklad kukurica, pšenica,bôby, sója alebo bavlníkovć rastliny, destílačnć zvyšky z výroby alkoholov, mäsové múčky alebo kvasnicové extrakty. Z anorganických solí môže živný roztok obsahovať napríklad chloridy, uhličitany, sírany alebo fosforečnany alebo alkalické kovy alebo kovy alkalických zemín, železo, zinok a mangan, ale aj amónne soli a dusičnany.Optimálne podmienky femientácie sú síce pre každý mikroorganízmus rozdielne, ale bud sú už odbomíkoviznáme alebo sa dajú zistiť pomocou ľahkých predbežných pokusov. Cistenie clostripainu sa môže robiť klasickými spôsobmi, napríklad zrážaním cez alumíniumsulfonát, pomocou iónomeničov alebo pomocou gélovej perrneačnej chromatografre. Agregácia enzýmu je možná bežnými metódami (Colowick a Kaplan, Meth. Enzymol., Vol. XLIV).Na enzymatickú konverziu sa môžu používať tak cele bunky vo voľnej alebo imobilízovanej forme, ako aj ízolovaný enzymatícký produkt, ktorý môže byť rovnako viazaný na nosič.Štíepenie preproínzulinov všeobecného vzorca (I) clostripainom sa robí vo vodnom prostredí, ku ktorému sa môžu pridávať rovnako s vodou miešateľné organické zložky,ako napríklad alkoholy, ketóny, močovina, N,N-dimetylformamid. l( reakčnej dávke sa môžu predovšetkým pre ľahšiu kontrolu hodnoty pH reakcie pridávať zodpovedajúce anorganické alebo organické pufry ako fosfát, Tris, Glycín HEPES a. i. Koncentrácia preproinzulínu sa behom štiepenia pohybuje napríklad medzi 0,01 mg/ml až 100 mg/ml,výhodne medzi 0,1 mg/ml až 10 mg/ml. Pomer preproinzuIínu k clostripainu robi /mg k unit (U) 1 0,01 až l 1000,výhodne 1 0,1 až l 50.Teplota pri reakcii sa môže rovnako meniť v širokom rozmedzí. Výhodne ide o teplotný rozsah medzi 0 °C až X 0 °C, hlavne potom teplota pohybujúca sa medzi 20 °C až 40 °C.Hodnota pH variácie sa môže meniť medzi pH 4 až pH 12, hlavne výhodná je oblasť medzi pH 6 až pH 9.Čas, ktorý je na konverziu preproinzulínov na zodpovedajúce intermediáty nevyhnutný, sa môže meniť podľa reakčných podmienok v širokom rozmedzí, napriklad sa môže pohybovať medzi 15 minútami až 48 h, výhodne sa reakcia pohybuje medzi l h až 6 h.Enzým sa pred použitím aktivuje vhodným spôsobom v prítomnosti merkaptánu. Ako merkaptány prichádzajú pritom v zásade do úvahy všetky zlúčeniny, ktoré obsahujú SH-skupiny, výhodne sa používa DTT, DTE, merkaptoetanol, tioglykolová kyselina alebo cystein. Koncentrácia merkaptánu sa môže meniť v širokom rozmedzí, výhodné sú koncentrácie medzi 0,1 mM až 100 mM. Aktivačný pufor obsahuje ďalej ióny Ca, výhodne CaClz. Aktivácia sa robi medzi pH 4 až pH 12, výhodne pri hodnote pH 6 až pH 8,najvýhodnejšia je oblasť pH 7 až pH 8. Na udržanie hodnoty pH sa môže pridať vhodná pufračná látka, napríklad Tris, HEPES, glycín a. i. Teplota aktivácie sa môže pohybovať medzi 0 °C až 60 °C, výhodná je oblasť 0 °C až 10 °C, najvýhodnejšie 0 °C až 5 °C. Takto aktivovaný enzým sa môže používať bud priamo, alebo sa pripadne môže pomocou chmmatografie cez R Ultrogel AcA 202 zbaviť aktivačnćho pufru.Štiepenie preproinzulínu všeobecného vzorca (I) podľa vynálezu vedie k derivátom inzulínu so zvyškami arginínu na C-terminálnom konci inzulínu a k zodpovedajúcim odštepným aminokyselinám alebo peptidom. Deriváty inzulínu sa môžu prípadne previesť pomocou karboxypeptidázy B na zodpovedajúce inzulíny. To sa môže stať súčasne s clostripainom v rovnakej reakčnej várke, ale aj za reakčných podmienok, uvedených, po sebe, pričom sa derivát inzulínu môže prípadne pred spracovaním s karboxypeptidázou B ízolovať známymi metódami, napríklad chromatograficky alebo kryštalizáciou. Karboxypeptidaza B sa môže použiť v rozpustenej alebo imobilízovanej fonne. Pomer karboxypeptidázy B k derivátu inzulínu robí (hmotnosť ku hmotnosti) asi 1 10 až 1 5000, výhodne asi l 500 až l 5000 anajvýhodnejšie asi l 1000 až l 3000.Pomer karboxypeptidázy B ku clostrípainu je (hmotnosť ku hmotnosti) asi 1 1 až 10 1 avýhodne 2 1 až 5 1.Reakčné produkty štiepenia clostripaínu alebo karboxypeptidázy B sa môžu napríklad vyzrážať znížením hodnoty pH alebo sa môžu čistiť pomocou známych metód stĺpcovej chromatograñe. Získaný inzulín sa môže pripraviť V obvyklých formách na podávanie a ako liečivo na liečenie diabetu mellitus (úplavice cukrovej ).V nasledujúcich, príkladoch je spôsob podľa vynálezu podrobne opísaný. Udaje o percentách sa týkajú hmotnostných percent. Ak to nie je uvedené inak, Príklad lKultivácia Clostridium histolyticum DSM 627 sa robi v živnom roztoku nasledujúceho zloženiaNaočkuje sa l predkultúra. Kultivácia sa robi v uzatvorených tľašiach za anaeróbnych podmienok pri 37 °C asi 2 dni. Kmeň mikroorganízmov sa uchováva v uvedenom živnom roztoku s 50 glycerínu pri - 20 °C. Fermentor sa naočkuje l predkultúry. Očkuje sa fermentor s obsahom 10 1 a 8 l žívnćho roztoku. Kultivácia sa robí pri zaplynovani dusíkom, pri 33 °C, 24 h, a konštantnom pH 7,0. Vo ñltráte kultúry bola namierená aktivita enzýmu 20 000 U/lSpracovanie sa robilo odstredením buniek asi pri 6000 g, sterilnou filtráciou cez filter s veľkosťou pórov 0,22 m,prídavkom 60 ľadovo studeného (-20 °C) metanolu k ñltrátu. Potom bol roztok udržiavaný 24 h pri -20 °C a potom odstredený (8000 g). Peleta bola rozpustená v sterilnej bidestilovanej vode a vznílcnutý roztok sa odstredil(12 000 g). V pelete bola nameraná aktivita enzýmu 300 U/ml, 200 U/mg proteínu. Výťažok predstavoval 75 nameranej aktivity vo fermentore.Príklad 2 Kultivácia buniek sa robila rovnako ako v príklade l. Produkčná médium vo fermentore pozostávalo zAktivita clostripaínu bola vo tiltráte kultúry 45 000 U/ml.Spracovanie sa robilo tangenciálnou-tlow-ñltráciou na 0,3 m membránach (Filtron, Omega Membran) na oddelenie buniek a tangenciálnou-flow-tiltráciou na l 0 KD membránach (Filtron, Omega Membran) na nakoncentrovanie rozpusteného clostripaínu. Činiteľ nakoncentrovania predstavuje 20. Potom bol koncentrát deionizovaný a chroInatografovaný cez DEAE-celulózu. Aktivita clostripaínu l 000 U/ml, výťažok 85 . Uskladnenie až do použitia enzymatického preparátu sa vykonáva pri -20 °C.na štiepiacu reakciu sa enzým zriedi V pomere l 40 25 mM Tris/HCl pufru, pH 7,8B. Štiepna dávka clostripaínu na uvoľnenie (B 3 l) Arginzulínuinkubácia 1 až 2 h pri 28 °C, reakcia sa môže ľahko kontrolovať pomocou HPLC, potom zastavenie reakcie s tosylL-lyzínchlórmetylketónom (TLCK),- zastavenie reakcie prídavkom l l TLCl( (15 mM)- výsledok humánny inzulin-Arg. Pomocou HPCL nie je namerateľný žiadny humánny inzulín (DesB 30),C. Štiepna dávka karboxypeptidáza B na uvoľnenie ľu ského inzulínu 200 l štiepnej dávky clostripaínu lO l karboxypeptidázy B (zriedený ll 00)- inkubácia 2 až 4 h pri 28 °C, reakcia sa dá ľahko preskúšať pomocou HPLC- na reakciu sa karboxypeptídáza B (750 U) ml, 150 U/mg,z pankreasu prasiat (zriedi v pomere 1 1000 25 mM Tris) HCl pufru, pH 7,8(DesB 30), ktorý je merateľný pomocou HPLC,D. Analytika HPLCŠtiepenie bolo kontrolované s použitím RP 18 stĺpca(0,l 25 M NH 4(SO 4)2, s HzSO 4 nastavené na hodnotu pH 4,25 - 50 gradient acetonitrilu), prípadne C 8 stlpca (0,1 TFA, 20 - 50 gradient acetonitrilu).Príklad 4 Clostripain 200 U/ml ( z príkladu l) aktivačný pufor 500 mM Tris/HCl, pH 7,8 100 mM DTT 25 mM CaClz Aktivácia 100 l roztoku clostripaínu 10 l aktivačnćho pufru Skladacia várka 35,7 mg ľudského pre-B-reťazec-A-reťazec inzulínu-S-sulfonátu 315 l l M merkaptoetanolu 105 l l M kyseliny askorbovej 100 ml 20 mM glycinového pufru, pH 10,7Skladanie sa vykonávalo cez noc v chladničke pri 4 °C,výťažok skladania predstavoval 0,152 mg/ml. Po oddelení nečistôt znížením pH pri pH 5,0 sa pridá Tris V konečnej koncentrácii 50 mM a hodnota pH sa nastaví pomocou HC na 7,8. Pridalo sa 30 l roztoku enzýmu. Štiepenie sa robilo pri 30 °C a sledovalo pomocou HPLC.

MPK / Značky

MPK: C07K 14/62

Značky: aminokyselin, reťazca, preproinzulínu, spôsob, hydrolýzy

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/5-279686-sposob-hydrolyzy-retazca-aminokyselin-preproinzulinu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob hydrolýzy reťazca aminokyselín preproinzulínu</a>

Podobne patenty