Spôsob mikrobiologickej výroby kyseliny 6-hydroxypikolínovej

Číslo patentu: 278496

Dátum: 16.09.1992

Autori: Heinzmann Klaus, Kiener Andreas, Glöckler Rainer

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný spôsob mikrobiologickej výroby kyseliny 6-hydroxypikolínovej z kyseliny pikolínovej a/alebo jej solí. Volí sa taká koncentrácia kyseliny pikolínovej a/alebo jej solí, aby sa kyselina 6-hydroxypikolínová ďalej nemetabolizovala. Tento spôsob sa uskutočňuje pomocou mikroorganizmov rodu Alcaligenes, ktoré rastú s kyselinou pikolínovou ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie. Ďalej je opísaný mikroorganizmus Alcaligenes faecalis DSM 6269.

Text

Pozerať všetko

Číslo príoritnej prihlášky 330/91-2 (Sl) Im c zKľąĺĺna Pľĺ 0 ľĺľy 5 CH (C l 2 P 17/12 ÚRAD Dátum zverejnenia 16.09.92 C 12 R 1 i 05) Dátum zverejnenia udelenia vo Vestníku 09.07.97 SLOVENSKEJ REPUBLIKY(73) Majiteľ patentu Lonza A. G.(Dir. Basel), Gampel/Wallís, CH(72) Pôvodca vynálezu Kiener Andreas, Dr., Visp (Kanton Wallis), CH Glöcklcr Rainer, Dipl. Biol., Vispertenninen (Kanton Wallis), CH Heinzmann Klaus, Visperterminen (Kanton Wallis), CH(54) Názov vynálezu Spôsob mikrobiologickej výroby kyseliny ő-hydroxypikolínovejJe opísaný spôsob mikrobiologickej výroby kyseliny G-hydroxypikolínovej z kyseliny pikolínovej a/alebo jej solí. Volí sa taká koncentrácia kyseliny pikolínovej a/alebo jej solí, aby sa kyselina 6-hydroxypikolínová ďalej nemetabolizovala. Tento spôsob sa uskutočňuje pomocou mikroorganizmov rodu Alcaligenes, ktoré rastú s kyselinou pikolínovou ako jediným zdrojom uhlíka,dusíka a energie. Ďalej je opísaný mikroorganizmus Alcaligenes faecalís DSM 6269.Vynález sa týka spôsobu mikrobíologickej výroby kyseliny 6-hydroxypikolínovej. Východiskovou látkou je kyselina pikolínová a/alebo jej soli.Kyselina ó-hydroxypikolínovà sa napríklad používa na vyrobu 2-oxypyrimidínu (Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft, 1912, 45, str. 2456-2467), ktorý je zas dôležitým medziproduktom na výrobu liečiv.Je známych niekoľko spôsobov výroby kyseliny 6-hydroxypikolínovej pomocou organických syntćz. Z kyseliny pikolínovej je možné získať napríklad kyselinu 6-hydroxypikolinovú reakciou s hydroxidom draselným(Tetrahedron Letters, zv. 29, str. 4389-4392, 1988). Nevýhoda tohto spôsobu však spočíva v tom, že sa kyselina ó-hydroxypikolínová získa v merateľnom výťažku, ktorý je len Sl .Je taktiež známe, že mikroorganizmy rodu Bacillus hydroxylujú kyselinu pikolínovú za vzniku kyseliny 6-hydroxypikolinovej (O. Shukla a S. M. Kaul, Indian J. of Biochemistry and Biophysics, zv. 10, str. 176-178, 1973,O. Shukla a spol., Indian J. of Biochemistry and Biophysics, zv. 14, str. 292-295, 1977), Veľká nevýhoda tohto spôsobu však spočíva v tom, že ďalší metabolický proces kyseliny 6-hydroxypikolínovej je možné zamedziť iba pomocou inhibitora arzenitanu sodného, čim sa rovnako brzdí rast mikroorganizmov. Ďalším nedostatkom je, že sa netvorl iba kyselina ó-hydroxypikolínová, ale zmes kyseliny 3,6-dihydroxypikolínovej a kyseliny ó-hydroxypikolínovej.R. L. Tate a J. C. Ensign, Can. J. Microbiol. zv. 20,str. 695-702,l 974 opísali hydroxyláciu kyseliny pikolínovej pomocou mikroorganizmov rodu Arthrobacter. Nevýhoda tohto spôsobu spočíva v tom, že mikroorganizmy nemôžu využívať kyselinu pikolínovú výlučne ako zdroj uhlíka, dusíka a energie.Vlastnosti kmeňa Alcaligenes faecalis DSM č. 6269bunková forma tyčinky šírka m 0,5-0,8 dĺžka m 1,2-2,0 pohyblivosť bičíky peritricha gram-reakcie lýza 3 KOH aminopeptidáza (Cerny) spóry oxidáza kataláza rast anaeróbny 37/40 °C /pH 5,6 Mac-Conkey-agar pigmenty 10Pri hydroxylácii musí byť tiež prítomný extrakt kvasníc,čo môže viesť k nežiaducemu znečisteniu produktu. Ďalším nedostatkom je, že sa kyselina ó-hydroxypikolínová tvorí len pri nízkom obsahu kyslíka, takže mikroorganizmy nie sú v rastovej fáze, a tým sa tvorí male množstvo produktu.Pojem kyselina píkolínová zahŕňa rovnako aj jej soli,ako napríklad jej vo vode rozpustnć alkalické soli, amónne soli alebo napríklad tiež zmes kyseliny pikolínovej a jej vo vode rozpustných alkalických solí.Úloha predloženého vynálezu spočíva v odstránení menovaných nedostatkov a v uskutočnení hospodámeho mikrobiologíckého spôsobu výroby kyseliny 6-hydroxypikolínovej, pričom sa získa produkt vysokej čistoty a vo vysokom výťažku.Úloha je riešená spôsobom podľa patentového nároku 1. Pri spôsobe výroby kyseliny ó-hydroxypikolínovej podľa vynálezu sa postupuje tak, že sa hydroxyluje kyselina pikolínová pomocou mikroorganizmu rodu Alcaligenes, ktorý rastie s kyselinou pikolínovou ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie. Volí sa taká koncentrácia kyseliny pikolínovej, aby kyselina ó-hydroxypikolínová nebola ďalej metabolizovaná, Koncentrácia kyseliny pikolínovej sa zvolí tak, aby nepresiahla 10 hmotn.Mikroorganízmy, ktoré rastú s kyselinou pikolínovou ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie, je možné izolovať metódami bežnými V odbore, napríklad z čistiacich zariadeni alebo z pôdy.Účelne sa na výrobu kyseliny ó-hydroxypikolínovej používa mikroorganízmus Alealigenes faecalís, ktorý bol 7. 12. 1990 uložený do Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr GmbH, Mascherodeweg lb, D-3300 Braunschweig, pod číslom 6269. Tento mikroorganizmus nebol dosiaľ známy.VP ODC N 02 z N 03 denitriñkácia fenylalaníndezamináza levan zo sacharózy lecitináza ureáza hydrolýza škrobu želatíny kazeínu DNA tweenu 80 eskulínu odbúranie tyrozínu SK 278496 B 6nedifundujúce difundujúce Íluoreskujúee pyokyanín kyselina z (OF test) glukózy aeróbne glukózy anaeróbne xylózy aeróbne plyn z glukózy kyselina z (ASS) glukózy fruktózy xylózy ONPG ADH LDC VP indol Na uskutočnenie hydroxylácie kyseliny pikolínovej je potrebné, aby kyselina ó-hydroxypikolínová nebola ďalej metabolizovaná.Z dôvodu hospodámosti musia byť splnené nasledujúce parametre pri hydroxylácii kyseliny pikolínoveja) Bunky by mali produkovať kyselinu ó-hydroxypikolínovú už v priebehu rastovej fázy.b) Hydroxyláza kyseliny pikolínovej má zostať aktívna po skončení rastu.c) Odbúranie kyseliny pikolínovej by malo byť zabrzdené na stupni kyseliny 6-hydroxypikolínovej.d) Produkt (kyselina ó-hydroxypikolínová) má byť obohatený v rastovom médiu.S prekvapením sa zistilo, že tieto parametre sú splnenć súčasne vtedy, keď sa v priebehu rastu mikroorganizmov, alebo tiež po rastovej fáze mikroorganizmov pridá take množstvo kyseliny pikolínovej, aby sa kyselina 6-hydroxypikolínová ďalej nemetabolizovala.Ako už bolo uvedené, kmeň rastie s kyselinou pikolínovou ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie. Napestovanie tohto kmeňa je možné uskutočniť kyselinou pikolínovou s koncentráciou 0,05 až 0,2 hmotnostných, pričom je kyselina pikolínová celkom metabolizovanâ.Ak sa zvýši koncentrácia kyseliny pikolínovej, potom sa brzdí rast buniek. Pri koncentrácii kyseliny pikolínovej nad 0,5 hmotnosmých, nedá sa už pozorovať rast. Ale aktivita hydroxylázy kyseliny pikolínovej zostáva v bunkách nezrnenená.potreba rastovej látky využitie substrátu acetát adipát kaprát citrát glykolát L-laktát levulinát malát malonát fenylacetát propionát suberát L-arabinóza fruktóza glukóza manóza maltóza xylóza ribóza manit glukonátÚčelne sa po napestovaní mikroorganizmov pridá 10 fo-ný (hmotn.) až nasýtený roztok kyseliny pikolínovej takou rýchlosťou, že koncentrácia kyseliny pikolínovej nepresiahne vo fermentore 10 hmotnostných. Výhodne ak koncentrácia kyseliny pikolínovej vo fermentore nepresiahne l hmotnosti.Účelne slúži roztok kyseliny pikolínovej spolu s roztokom alkalickćho hydroxidu na reguláciu hodnoty pH kultivačného média. Ako alkalický hydroxid je možné použiť napríklad hydroxid sodný alebo hydroxid draselný. Ako kultivačné médium sa môžu použiť v odbore bežne používané média výhodne sa používa médium s minerálnymi soľarni, ktorého zloženie je uvedené v tabuľke 2.Účelne je obsah kyslíka v kultivačnom médiu v priebehu hydroxylácie až do 90 maximálneho nasýtenia,výhodne je obsah kyslíka v rozmedzí od 0,1 do 50 maximálneho nasýtenia.Hydroxylácia kyseliny pikolínovej sa uskutočňuje v priebehu rastovej fázy alebo po nej.Hodnota pH je účelne v priebehu rastovej fáze alebo po nej medzi pH 4 a 10, výhodne medzi 5 a 9.Hydroxylácia sa uskutočňuje účelne pri teplote od 10 do 60 °C, výhodne od 15 do 40 °C.Na dodatočnému zvýšenie koncentrácie produktu sa podľa výhodnćho uskutočnenia vynálezu pridáva alkalická sol kyseliny pikolínovej, pričom prívod alkalickej soli kyseliny pikolínovej je riadený reguláciou parciálneho tlaku kyslíka vo fermentore.Alkalická soľ kyseliny pikolínovej sa účelne pridávatakou rýchlosťou, aby koncentrácia soli kyseliny pikolínovej vo fermentore nepresiahla 10 hmotnostných, výhodne aby nepresiahla l hmotnostné.Po oddelení buniek z kultivačného média, napríklad centrifugáciou alebo mikroñltráciou, sa číry roztok okyslí, pričom sa vyzráža kyselina ó-hydroxypíkolínová. Aby sa dosiahla optimálna kryštalizácía, roztok sa výhodne okysľuje pri 60 °C. Číry roztok je však možné použiť pre ďalšiu reakciu i bez spracovania.Príklad l Izolácia Alcaligenes faecalis (DSM 6269)Míkroorganizmy aeróbne metabolizujúce kyselinu pikolínovú sa obohacujú v AN médiu (tabuľka l) s prídavkom 0,1 (hmotnosť/objem) kyseliny pikolínovej ako jediným zdrojom uhlíka a energie. Všeobecné metódy na izoláciu mikrooganizmov sú opísané napríklad v G. Drews, Mikrobiologisches Praktikum, 4. vydanie, nakladateľstvo Springer, 1983, str. l-84. Ako inokulum sa používajú vzorky pôdy alebo vzorky z čistiaceho mriadenia. Obohatené vzorky sa kultivujú V trepacích bankách pri 30 °C. Po trojnásobnom preočkovaní do čerstvého média sa obohatené vzorky rozotrú na rovnake médium s prídavkom 16 g agam na liter a inkubujú sa pri 30 °C. Po niekoľkonásobnom rozotretí na agarové médium sa môžu izolovať čisté kultúry.Alcaligenes faecalis (DSM 6269) sa kultivuje aeróbne v médiu obsahujúcom minerálne soli (tabuľka 2) s kyselinou pikolínovou ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie pri pH 7 a pri teplote 30 °C. Na napestovanie slúži 20 litrový fennentor s pracovným objemom cca 15 l. Na reguláciu pH sa dávkuje 4,06 mol/l (50 hmotnosť/objem, cca 2 l) roztoku kyseliny pikolínovej a 3 mol/l (12 hmotnosť/objem, menej ako 20 ml) roztoku hydroxidu sodného v priebehu 27 hodín. Potom sa dokázalo vo fermentačnom roztoku 0,14 mol/l (2 hmotnosť/objem) kyseliny ó-hydroxypikolinovej a 16 mmol/l(0,18 hmotnosť/objem) kyseliny pikolínovej. K tomuto časovému bodu tvorí obsah kyslíka 1 sýtenia pri presýtení vzduchom 30 l/min. a pri rýchlosti miešania 750 otáčok/min.Hydroxylácia po rastovej fázePo rastovej fáze sa davkuje do fermentora 2,7 mol/l(47 hmotnosť/objem, cca 2,5 l) roztoku pikolinám sodného (pH 7) V priebehu 15 hodín. Rýchlosť dávkovania roztoku pikolinátu sodného je riadená reguláciou parciúlneho tlaku kyslíka fermentora tak, aby obsah kyslíka neprekročil 20 nasýtenie, pričom koncentrácia pikolínátuje cca 20 mmol/l (0,22 hmotnosť/objem). Pri koncentrácii 0,7 mol/l (9,8 hmotnosť/objem) kyseliny 6-hydroxypikollnovej a celkovom čase fermentácie 42 hodín sa pridávanie preruší. Na celú náplň sa dohromady použije 17,8 mol (2190 g) kyseliny pikolínovej vo forme voľnej kyseliny a sodnej soli. Z kyseliny pikolínovej, prípadne jej sodnej soli sa po okysleni bezbunkovćho roztoku izoluje 13,3 mol (1850 g) kyseliny 6-hydroxypikolínovej v kryštalickej fomie. To zodpovedávýťažku 74 vztiahnuté na vnesenú kyselinu pikolínovú. Z výsledkov HPLC-analýzy vyplýva 95 -ná Čistota kyseliny 6-hydroxypikolínovej. V čirom ñltràte je možné dokázať 0,13 mol (18,5 g) kyseliny ó-hydroxypikolínovej, čo zodpovedá 0,75 vnesenej kyseliny pikolínovej a 0,3 mol (37 g) kyseliny pikolínovej, čo zodpovedá 1,7 vnesenej kyseliny pikolínovej.(NH,),s 0, 2000 Nazi-IPD., 2000 KH,1 o,. 1000 NaCl 3000 Mgci, . 6 11,0 400 CaCl, . 2 11,0 14,5 reci, . 6 11,0 0,3 pyridoxalhydrochlorid 10.103 riboŕlavín 5.103 amid kyseliny nikotĺnovej 5.l 03 tiamínhydrochlorid 210-3 biotín 210-3 kyselina pantotćnová 5. l 03 p-aminobenzoát 510-3 kyselina listová 210-3 vitamín 13 510-3 znso., . 7 11,0 10010-3 MnCl, . 4 H,o 9010-3 11,130, 30010-3 coc 1,. s 11,0 200.103 cucl, . 2 11,0 1010-3 N 101, . 6 H,0 2010-3 Na,Moo, . 2 11,0 3010-3 EDTANa, . 2 H,o 5.103 Faso 7 11,0 210-3(pH roztoku sa po pridaní kyseliny pikolínovej upraví na hodnotu 7,0)Tabuľka 2 Zloženie média obsahujúceho minerálne soliZloženie roztoku stopových prvkov(pH roztoku sa upraví na hodnotu 7,0

MPK / Značky

MPK: C12P 17/12, C12N 1/20

Značky: výroby, 6-hydroxypikolínovej, kyseliny, mikrobiologickej, spôsob

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/5-278496-sposob-mikrobiologickej-vyroby-kyseliny-6-hydroxypikolinovej.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob mikrobiologickej výroby kyseliny 6-hydroxypikolínovej</a>

Podobne patenty