Mikroorganizmy Alcaligenes faecalis a mikrobiologický spôsob výroby kyseliny 6-hydroxypikolínovej

Číslo patentu: 278423

Dátum: 14.10.1992

Autor: Kiener Andreas

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Mikrobiologický spôsob výroby kyseliny 6-hydroxypikolínovej z 2-kyanpyridínu, je založený na použití nových mikroorganizmov rodu Alcaligenes, ktoré sú schopné rásť s 2-kyanpyridínom ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie, a ako substrát ho biotransformovať na kyselinu 6-hydroxypikolínovú. Opisujú sa mikroorganizmy Alcaligenes faecalis DSM 6335.

Text

Pozerať všetko

Cislo prioritnej prihlášky 812/91-9C IZP 17/12 Dátum priority 18.03.91 C 12) 17/10 C 12 N 1/20// Krajina priority CH (C 1 gp 17,12 A C 12 R 105)ÚRAD Dátum zverejnenia 14.10.92 PRIEMYSELNÉHO VLASTNÍCTVA Dátum zverejnenia udelenia v 0 Vestníku 07.05.97 SLOVENSKEJ REPUBLIKY(73) Majiteľ patentu Lonza A. G., (DirzzBasel), Gampel/Wallis, CH(72) Pôvodca vynálezu Kiener Andreas, Dr., Visp (Kanton Wallis), CH(54) Názov vynálezu Mikroorganizmy Alcaligenes faecalis a mikrobiologický spôsob výroby kyseliny 6-hydroxypikolínovejMikrobiologický spôsob výroby kyseliny ó-hydroxypikolínovej z Z-kyanpyridínu, je založený na použití nových mikroorganízmov rodu Alcaligenes, ktore sú schopne rásť s Z-kyanpyridínom ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie, a ako substrát ho biotransformovať na kyselinu ó-hydroxypikolínovú. Opísujú sa mikroorganizmy Alcaligenes faecalis DSM 6335.Vynález sa týka mikrobiologickěho spôsobu výroby kyseliny ó-hydroxypikolinovej z Z-kyanpyridinu a mikroorganizmov vhodných na tento spôsob výroby.Kyselina ő-hydroxypikolínová sa napríklad používa na výrobu Z-oxopyrimidírtu (Berichte der Deutschen Chemischen Gesellschaft, 1912, 45, str. 2456-2467), ktorýje zas dôležitým medziproduktom na výrobu liečiv.Je známe, že mikroorganizmy rodu Bacillus hydroxylujú kyselinu pikolínovú za vzniku kyseliny 6-hydroxypikolínovej (O. Shukla a S. M. Kaul, Indian J. of Biochemistry and Biophysics, zv. 10, str. 176-178,1973, O. Shukla a spol., Indian J. of Biochemistry and Biophysics, zv. 14, str. 292-295, 1977).Veľká nevýhoda tohto spôsobu však spočíva v tom,že ďalší metabolický proces kyseliny ó-hydroxypikolinovej je možné zamedziť iba pomocou inhíbítora arzenitanu sodného, čím sa tiež brzdí rast mikroorganizmov. Ďalším nedostatkom je, že sa netvorí iba kyselina Ó-hydroxypikolínová, ale zmes kyseliny 3,6-dihydroxypikolínovej a kyseliny 6-hydroxypikolínovej.R. L. Tate a J. C. Ensign, Can. J. Microbiol. zv. 20,str. 695-702, 1974 opisali hydroxyláciu kyseliny pikolínovej pomocou mikroorganizmov rodu Arthrobacter. Nevýhoda tohto spôsobu spočíva V tom, že mikroorganizmy nemôžu využívať kyselinu pikolinovú výlučne ako zdroj uhlíka, dusíka a energie. Pri hydroxylácii musi byť totiž prítomný extrakt kvasníc, čo môže viesť 1( nežiaducemu znečisteniu produktu. Ďalším nedostatkom je, že saVedecký opis mikroorganizmov Alkaligenes faecalis (DSM 6334)kyselina ó-hydroxypikolinovà tvorí len pri nízkom obsahu kyslíka, takže mikroorganizmy nie sú v rastovej fáze, a tým sa tvori male množstvo produktu.Úlohou predloženého vynálezu je odstrániť uvedene nedostatky a dať na použitie jednoduchý, hospodárny mikrobiologický spôsob výroby kyseliny 6-hydroxypikolinovej z Z-kyanpyridínu.Úloha sa vyriešila spôsobom podľa patentového nároku 2, ktorý sa uskutočňuje pomocou mikroorganizmov podľa patentového nároku l.Podľa vynálezu sú vhodne všetky mikroorganizmy,ktoré sú schopné rásť s 2-kyanpyridinom ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie, a ten ako substrát premeniť na kyselinu ó-hydroxypikolínovú.Tieto mikroorganizmy sú súčasťou vynálezu a je ich možne pomocou obvyklýeh mikrobiologických p 0 stupov oddelliť a izolovať pomocou 2-kyanpyridínu ako rastovćho substrátu napriklad z čistiacich zariadení.Pojem mikroorganizmy, ktoré sú schopne rásť s 2-kyanpyridinom ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie, zahŕňa ako zmesi mikroorganizmov, taktiež čisté izoláty týchto mikroorganizmov, ktoré sa používajú za sterilných alebo nesterilných fermentačných podmienok.Účelne sa používajú mikroorganizmy Alcaligenes faecalis a ich descendenty a mutanty. Tieto mikroorganizmy boli uložené 31. 1. 1991 do Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr GmbH(DSM),Mascheroderweg lb, D-3000 Braunschweig pod označením DSM 6335.pigmenty nedifunduj úce difundujúce fluoreskuúcefenylalaníndesamináza levan zo sacharózyhydrolýza škrobu želatíny kazeínu DNA Tweenu 80 eskulinukyselina z (OF-test) glukózy aeróbne glukózy anaeróbne xylózy aeróbneSpôsob výroby kyseliny G-hydroxypikolínovej sa podľa vynálezu uskutočňuje tak, že sa Z-kyanpyridín biotransformuje jedným z týchto mikroorganizmov na kyselinu G-hydroxypikolínovú a tá sa akumuluje v mediu.Pred vlastnou reakciou sa mikroorganizmy kultivujú(pestujú) zvyčajným spôsobom a účinné enzýmy mikroorganizmov sa účelne indukujú Z-kyanpyridínom.Zvyčajne sa kultivácia (pestovanie) a indukcia uskutoční s 2-kyanpyridínom v koncentrácii od 0,0 l do 20 hmotnostných, výhodne V koncentrácii od 0,1 do l hmotnostného.Potom sa môžu mikroorganizmy získať buď pred pridaním substrátu (Z-kyanpyridínu) bežnými deliacimi postupmi, alebo sa substrát (Z-kyanpyridín) môže pridávať priamo k mikroorganizmom.Na vlastný spôsob výroby sa potom bunková suspenzia upraví na hodnotu optickej hustoty pri 650 nm od l do 100, výhodne na hodnotu optickej hustoty od 5 do 80.Ako médiá sa môžu použiť v odbore bežne používané médiá Výhodne sa používa jedno z médií, ktorých zloženie je uvedene v tabuľke l a 2.Substrát 2-kyanpyridín sa na výrobu kyseliny 6-hydroxypikolínovej môže pridávať jednorazovo alebo kontinuálne. Substrát sa účelne pridáva tak, aby koncentrácia substrátu v médiu nepresiahla 20 hmotnosti, výhodne sa pridáva tak, aby koncentrácia substrátu nepresiahla 10 hmotnosti. Zvyčajne sa premena 2-kyanpyridlnu na kyselinu ó-hydroxypikolinovú uskutočňuje s bunkami v pokoji.levulinát malát malonát mezakonát fenylacetát pimelàt sebakinát D-tartrát L-arabinóza fruktóza glukóza manóza maltóza xylóza ribóza mannit glukonát Z-ketoglukonát N-acetylglukozamin L-metionín hydroxybenzoátVÝSLEDOK kmeň Kie 31Hodnota pH reakcie je účelne v rozmedzí od 4 do l 0, výhodne V rozmedzí od 5 do 9.Reakcia sa uskutočňuje účelne pri teplote od 10 do 50 °C, výhodne pri teplote od 20 do 40 °C.Po obvyklom reakčnom čase od l do 100 hodin je možne kyselinu 6-hydroxypikolínovú izolovať napríklad okyslením bezbunkového fermentačného roztoku.Príklad l Izolácia mikroorganizmov metabolizujúcich 2-kyanpyridínAeróbne mikroorganizmy metabolizujúce 2-kyanpyridín sa obohatia v AN-mćdiu (tabuľka l) s pridavkom 0,1 hmotnosti/objem Z-kyanpyridínu ako jediného zdroja uhlíka a energie. Všeobecné metódy izolácie mikroorganizmov sú opísane napríklad v G. Drews, Míkrobiologisches Praktikum, 4. vydanie,Springer Verlag, 1983. Ako inokulum sa používajú vzorky z čistiacich zariadení.Obohatené kultúry sa pestujú V trepacích bankách pri 30 °C. Po trojnásobnom preočkovanl do čerstvého média sa obohatené kultúry rozotrú na rovnake médium s prídavkom 16 g agam na liter a inkubujú sa pri 30 °C. Po viacnásobnom rozotretí na agarovom médiu je možné izolovať čisté kultúry.amid kyseliny nikotinovej tiaminhydrochlorid biotlnkyselina pantotenová p-amínobenzoát kyselina listová vitamin B 12(pH roztoku sa upraví na hodnotu 7,0)a) Alcaligenes faecalis DSM 6335 sa pestuje vo fermentore V AN-médiu (tabuľka l) za pridania 0,1 hmotnosti/objem Z-kyanpyridínu pri hodnote pH 7 a pri teplote 30 °C. Potom sa bunky odstredia, resuspendujú v AN-médiu a upraví sa optická hustota pri 650 nm na hodnotu 10. Táto bunková suspenzia sa dá do trepacej banky a zmieša sa s 0,1 mol/l (10,4 g/l) Z-kyanpyridínu. Po 16 hodinovej inkubácii pri 30 °C na trepacom zariadení je možné pomocou analytických metód V bezbunkovom roztoku dokázať 0,04 mol/l (5,5 g/l) kyseliny 6-hydroxypikolínovejĺ To zodpovedá 40-percentnému výťažku, vztiahnuté na vnesený Z-kyanpyridin.Tabuľka 2 Zloženie média obsahujúceho minerálne solib) Alcaligenes faecalis DSM č. 6335 sa pestuje vo fermentore (pracovný objem 5,5 l) v médiu obsahujúcom minerálne soli (tabuľka 2) za pridania 0,1 hmotnosti/objem Z-kyanpyridínu pri hodnote pH 7 a pri teplote 30 °C. Na úpravu pH sa použije 3 mol/l hydroxidu sodnćho a 8,5 hmotnosti/objem kyseliny fosforečnej. V priebehu rastu sa dodatočne pridáva do fermentora Z-kyanpyridin, až kým po 24 hodinách rastu optická hustota nedosiahne pri 650 nm hodnotu 5,1. Celkom sa v priebehu rastovej fázy metabolizuje 35 g Z-kyanpyridinu.Na výrobu kyseliny ó-hydroxypikolínovej sa suspenzia mikroorganizmov zmieša s Z-kyanpyridínom (220 g). Po ďalšej 18 hodinovej inkubácii sa izoluje z bezbunkovćho roztoku 108 g kyseliny ó-hydroxypikolinovej, čo zodpovedá výrťažku 37 , vztiałmutć na vnesený 2-kyanpyridin.

MPK / Značky

MPK: C12P 17/12, C12P 17/10, C12N 1/20

Značky: mikrobiologický, faecalis, kyseliny, spôsob, alcaligenes, mikroorganizmy, 6-hydroxypikolínovej, výroby

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/5-278423-mikroorganizmy-alcaligenes-faecalis-a-mikrobiologicky-sposob-vyroby-kyseliny-6-hydroxypikolinovej.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Mikroorganizmy Alcaligenes faecalis a mikrobiologický spôsob výroby kyseliny 6-hydroxypikolínovej</a>

Podobne patenty