Způsob přípravy radioaktivních nukleosidů značených radioizotopem 14C resp. 3H

Číslo patentu: 267846

Dátum: 12.02.1990

Autori: Nejedlý Zdeněk, Veselá Martina, Filip Jiří

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

(22) Přihlášeno 10 11 88 c 07 1-1 19 x 57 FEDERÁLNiÚŘAD (40) Zveřejněno 12 07 as PRO VYNÁLEZY (45) Vľdáno 02 07 9 °(54) Způsob přípravy radioaktivních nukleosidů(57) Řešení se týki způsobu přípravy radionktivních nukleoaidů značených radioizotopem 14 Č resp. 3 H, přenčnou basi nuklecvých kyselín, značených radioizoto~ pem 140 resp. 3 H či neznačených, na nukleosídy značcné 14 C resp. 3 H. Příprava radioaktivních nukleosidů značených radíoizotopcm ląc resp. 3 H sc provádí v přitcmnosti 2-deoxy-gz-D-ribosa-hrosráą tu, 0-D-ribosa-1-fosfátu nebo nukleosidů, neznačcných případně značćných nespccificky radioizotopcm 140, ve vodnćm prostředí, při reakční teplctč v rozmezí 3 °C až 38 °C, katalytickým účinkem bíokatalyzátoru, připraveućho 2 łakterií. Podstata spočívá v tom, že jako Biokatalyzáàor se použijí bakterie Escherichia alcalcscens, ímobílizovanć zahudováním do polynkrylamidového gelu.Předmětem vynálezu je způsob přípravy radioaktivních nukleosidú znnčených radioizotopem ľ 4 C, resp. 38, založený na využití katalytických vlastncstí iiokatalyzátcru připravenćho z bakterií Escherichin nlcalescens, který katalyzuje přenos riłcsylovéneho deoxyrihosylové skupiny ze specifických donnrů tšchto funkčních skupin /I(-D-ribcsa-1-fnsfát resp. 2-deoxy-6(-D-ribosa-1-fosfět/, případně přenos ribosylovć čí decxyribcsylové skupiny nukleosidů, na bázi nukleově kyseliny značenou radioizctopem 140, resp. JH, případně neznačenou alternativně lze jako donory ribosylových nebšidecxy~riicsylových skupin aplikovat nukleosidy nespecíficky značené radioizotopen L.Produkty uvedených rcakcí jsou radioaktivní nukleosidy, značenć radíoizotnpem totálně neöo alternatívu v bázi, resp. deoxyribosylovém zbytku, případně nuklecsidy značenć radioizotopem 3 H v bázi.Studium biologické funkce nukleových kyselin v živých organismech je stále středem zájmu řady vědních disciplín. Pro úspěšné řešení řady problémů tohoto studia má využití nukleosidů značených radioizotopy 140 nebo 33 zásadní význam, a aplikační šíře těchto slcučenin je tudíž značná. Vzhledem k tomu je i zkoumání účinných způsobü značení nukleosidů radioizotopy nadále záležitostí vysoce aktuální.140, resp. 3 H, vy Stávající způsoby připravy nukleosidů značených radioizotopy cházejí z metodických možností organické syntézy, hiosyntćzy a enzymatickěrsyntćzy. Postupy organické syntćzy jsou nejmćnä vhodné, a to pro nutnost specifického chránční funkčních skupin radioaktivního substrátu, zpravidla větší počet reakčních stupňů, a rovněž z hlediska požadavku vysoké stereoizomerickć čistoty nukleosidů značených radioizotopy. Dobré možnosti pro přípravu nukleosidú znnčených radioizotopem 140, případně 35, poskytuje metodické oblast biosyntćzy a enzymatickć syntéžy /Nejedlý Z.,Filip J., Kolina J., Ekl J. a Grünlerger D., čs. AG 121 808 Kalina J., Vendlová J.,Nejedlý Z., Filip J., Plander E., Šctlík I., Zachler V. a Latzel K., čs. AC 1512 T Williams, D.1., Can. J. Chem. 39, 1742 /1962/ Cardinaud R. a Viswanathan K.V., J. Laielled Compounds 3, 35 /1966/ Filip J. a Nejedlý Z., J. Labelled Compounds 2, 128/1967/ Nejedlý Z., Filip J. a Ekl J., J. Labelled Compounds Q, 149 /1967/ Filip J.,äejedlý Z., Čihák A. a Veselý J., čs. A 0 194 C 13 Hejedlý Z., Filip J., Peč V. a Kclina J., čs. A 0 206 950/. Biosyntézou lze připravit pcuze nukleosidy značenć radicízotopem 140 nespeciíícky, a jejich příprava ze složité směsi reakčních produktů je komplikoväna vícestupňovými frakcionačnímí, izolačními a purifikačními postupy. Enzymatickou syntězou lze naopak připravit nukleosidy značeně radioizotopy v jediuěm reakčním stupni a izolovat je z reakčních směsí jediným zvolenýn chronatografickýn pcstupem. Navíc umožňuje enzymatickä syntézu více alternativních způsobů specifického značení nukleosidů radioizotopem 14 C, resp. 3 H. Nevýhodcu enzymatických postupů lze spatřovat v ton, že enzymovć preparáty - izolované často s vysokým stupněm purifikace - lze aplikovat pouze jednorázovč. Značný problém spcčívá dále v účinném odstranění enzymatických preparátů z reakčních směsí po ukončení reakce, aniž by docháze~ lo ke ztrátám radíoaktivního materiálu. Tyto nedostatky enzymatícké syntézy nuklecsidú značených radioizctopy odstraňují ty postupy, které místo purifikovaných enzynových preparatü aplikují intaktní bakteríální bunky imohilizované zahudováním do interních nosičů jako iiokatalyzátory příkladem je využití buněk bakteríí Escheri chia coli SPT imobilizovaných zabudováním do alginátového gelu jako liokatalyzätorupro přípravu purinových 2-deoxy-L-D-ríbonukleosidů, (čs. autorske osvědčení č. 254 375), a dále využití bakterií Escherichin coli B, ímóbilizovaných zabudováním do tćhož gelu, pro příprava radioaktivního thymidinu značenćho radioizotopem 14 C,(čs. autorské osvědčenĺ č- 254 375 (PV 8553-86).Je objektivní nevýhodou postupů užívajicích jako iiokatalyzátorü bakteriálních buněk zabudovaných do alginátovćho gelu, že reakce nelze zásadu provádčt v prostředí fosfátcvých pufrů či v přítomnosti organických fosfátů, pretože dochází k okamžité n inensívní destrukci částic łiokatzlyzútoru.Výše uvedené nedostatky nemá způsob přípravy radicaktivních nuklecsidů, značenýh radioizotopem 140, resp. 3 H, přenosem báze nukleové kyseliny, značeně radicizctcpem C, resp. 3 H nebo neznačená, na nukleosid značený 14 C, resp. 33, v přítcmnosti neradioaktívního d(~D-riiosa-1-fosfátu nebo 2-deoxy-0(-D-ribosa-1-fosfátu, případn v přítomností nukleosidů značených nespecificky radioizotopem 140 nebo neznačených, jako doncrů ribosylových či 2-deoxyribosylových skupin, ve vodněm prostředí o pH 6,8 až 7,2, při reakční teplot 3 °C až 38 °C, katalyzovaný účinkem hiokatalyzátcru, jehož podstata spočívá v tom, že jako biokatalyzátcru se použije iunřk Bnkterií Escherichia alcalescens imobilizovaných zahudoväním do polyakrylamidového gelu.Způsob příprary radíoaktivních nukleosidů značených radioizotopen l 4 C, resp. 33,podle vynálezu využívá skutečnosti, že v imolilizcvaných Bakteríálních buňkäch použitých jako iiokntalyzátory jsou přitonny enzymy ze skupiny pentosyltransferas, a to purin-nukleosidfosforylasa lE.C., 2.4.2.1.J , pyrimidin~nukleosidfosforylasa E.C.,2.4.2.2 , uridinfosforylasa E.C., 2.4.2.3.7, thymidinfcsforylasa E.C., 2.4.2.43 případně nukleosidríhosyltransferasa E.C., 2.4.2.5.7 a nukleosid-decxyribosyltransferasa E.C., 2.4.2.6.J , které katalyzují přenos ribosylových či 2-deoxyri)csy 1 ových skupin mezi jejich shorauůedenými donory, značenými nespecificky radioizctcpem 140 neio neznačenými, a házemi nukleových kyselín značenými radicizotcpem 140, resp. 3 H nebo neznačenými.Imohilizace bakterií Escherichia alcalescens do polyakrylamidovćhc gelu se provede známým postupen /Škodová H., Chaloupka J., a Škoda J., Biotechnol. Bioeng. gg,2151 /1981//.Princíp přípravy radioaktivnich nukleosidů značených radioizotopen 14 C, resp. JH, podle vynälezu spočívá v tom, že se háze nukleovć kyseliny značení radioizotopem làc, resp. JH, nebo neznačená, ponechd reagovat s donorem ribosylových resp. 2-decxyriiosylových skupin /U(-D-riiosa-1-fosfát, 2 ~deoxy-4(-D-ribosa-lwfosfát, nukleosid/,značeným nespecificky radioizotopem 140 neio neznačeným, V přítomnost biokatalyzátcru. Reakce probihú ve vodnćm prostředí, při pH 6,8 až 7,2, po doiu näkolika hodin pri teplctě V roznezí 3 °C až 38 °C. Po ukončení reakce se reakční směs oddřli cd iickatalyzätoru, a dále zpracuje konvenčnimi chromatografickými postupy tak, že se izolude nukleosid značený radioizotopem § 40, resp. JH a veškeré další reakční produkty značenć 140, resp. 38. Biokatalyzítor se několikrät promyje fyziclcgickýn roztokem a ve fyziologickém roztoku uskladni při teplote 5 CC takto je připraven k aplikaci v dal ších výrobních äaržích.Způsob přípravy radioaktivnich nukleosidů značených radioizotopem 140, resp. 33,podle předmětněho vynálezu má následující zásadní výhody1/ Imohilizované bakteriální buňky, používané jako iiokatalyzátory, se v enzymntických reakcích neaplikují jednoräzovä, ale lze je s výhodou aplikovat opakovan ve více produkčních šaržích, Biokatalyzútory se dlouhodobě přechovívaji v prostředí fyziologickćho roztoku při teplote 5 °C, ani dochází ke ztrltč jejich enzyaovć aktivity.2/ Katalytickć reakce akceptorů a donorů ribosylových resp. 2-deoxyribosylových skupin pomocí biokatalyzätoru lze alternovat tak, že se získají radioaktivní nuk 1 eosi~ dy, značné radioizotopem 140, resp. 3 H iud v bázi, nebo radioizotopem 140 v riboaylovć neho 2-deoxyribosylově skupině, případně radioizotopem 140 nespecificky.3/ Substrátová specirika Biokatalyzútoru je nízká, což dcvolujc aplikovat například Ade, Gua, Urn a Thy jako akceptory riłosylových, resp. 2-dcoxyríöcsylcvých 5 ku~ piu,aň -D-ribosa-1-fonfát, Ado, Guo, Urd a Cyd jake doncry ribosylových skupin, a 2-deoxy-aĺ~D-ribosa-1-fosľät, dAdo, dGuo, dUrd, dCyd a dThd jako doncry ziaecxyrikosylových skupin. Tato okolnost primérnř určuje vhcdncst způsohu připrnvy radioaktivních nukleosidů podle vynälezu pro pŕípravu Ado, dAdo, Cuc, dGuo, Urd, dUrd4/ Biokatalyzátor je permenbilní pro nkceptory i donory rihosylových resp. 2-deoxyríłosylových skupin a pre všechny reaköní produkty. Biofaktor lze aplikovat ve vodném prostředí i v prostředí libovolného pufru, například fcsfätovéhc pufru, a dále V přitomnosti organických fosfätů, například 04-D~ri 3 osa-1-fosfätu neho 2-detxy-aĺ-D-ribesu-1-fosfätu, aniž dochází k jchc poškození neło úplné destrukči.Způsob přípravy radioaktivních nuklecsidů značených radioizctopem 140, resp. 3 H dále je uveden na přikladcch, aniž je tím omezcna aplikační šíře použitého principu.ml vcůcvćho roztoku 0 pH 7,0 Byla v přítomnosti biokatalyzätoru /0,5 5 vlhké hmotnosti/ inkubována za třcpání při tcplotě 20 °C po dobu C,5 h. Chromntcgrafickou analýzou rcakčni směsi na papíře Whâtman č. 3 v soustavš 1-iutanol nasycený vodcu äylo prekázáno, že konvcrsc EILJ 4 CJ Ade na ndenin-U-140 Ado probčhla kvantitativnč. Biokatalyzátor byl oddělcn od rcakční směsi, promyt fyzíologickým roztokem a uskladněn ve fyziologickém roztoku při 5 °C pro další aplikace. Reakční směs byla chromatcgrafnvéna na papíře Whatman č. 3 ve shora uvedeném rozpcuštčdlovém systému. Bylo izolcvénc 37,3 MBq /91/ ndenin-U-14 C ndenosinu o molové radioaktivitč 10,3 GBq.mmo 1-1 a radicchemické čistotě vyšší než 98 ./ICC /umol/ v 5 ml vodného roztoku o pH 7,2 byla v přítomnosti iiokatalyzátoru /1,C g vlhké hmotnosti/ inkukována za třepání při tcplotě 2 C OC po dobu 24 h. Chronütografická analýzu reakční směsi na papíře Whatmnn č. 3 v soustavě ethylacetát nasycený vodou ukázala, že konvcrsc Ž-14 Q thyninu na 2-14 Qjthymidin prohěhla na 82 . Biokntalyzátor łyl od reakčni směsi oddčlen. Reakční směs byla nejprve chronntcgrafcvána na papiřc whatmnn č. 3 ve shora uvedeným rozpouštědlovém systému, a izclcvaný Ľ 2-14 C 7 thymidin Byl poté rcchromatografcván v soustavč 1-łutanol nasyccný vodou. Bylç izolováno 25,5 Mq /69 / 2-14 C 7 thymidinu 0 molové radioaktivitě 1,85 GBQ. mmcl 1 2 radiochemické čistotě vyšší než 98 .Směs 8-Jüjadeniuu /2 /pmol 1,03 GBq/ a 2-docxy-0(-D-rihoea-1-fosfátu /2 /umcl/ v 6,8 ml vodného roztoku o pH 6,9 Byla v přitomnosti iiokatalyzátoru /0,2 g vlhké hmotnosti/ inkubována za třepání při teplotě 22 °C po dobu 0,5 h.

MPK / Značky

MPK: C07H 19/067

Značky: radioizotopem, značených, přípravy, radioaktivních, resp, způsob, nukleosidů

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/5-267846-zpusob-pripravy-radioaktivnich-nukleosidu-znacenych-radioizotopem-14c-resp-3h.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Způsob přípravy radioaktivních nukleosidů značených radioizotopem 14C resp. 3H</a>

Podobne patenty