Způsob kultivace produkčního kmene Streptomyces aureofaciens pro výrobu chlortetracyklinu

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

FEDERÁLNÍ ÚŘAD PRO VYNÁLEZYZpůsob kultívace produkčního kmene Streptomyces aureofaciens pro výrobu chlortctracyklinu(57) Řešení se týká optimalizace podmínek kultivace produkčního kmene Streptomyces aureofnciens a biosyntézy chlortetracyklínu. Navrženým postupem se dosáhne toho, že při přípravě produkčního media se uvolni z kukuříčněho extraktu větší množství anínokyselín, zejména basických, které zmenší hodnotu bezrozměrného poměru CN již na počátku růstově fáze. Vypracovánfm dávkovacího režimu snadno přístupnéhc sacharidíckého zdroje se dosáhne toho, že se zvýši aktivita enzýmů sckundárního metabolísmu. Hladina sacharosy se reguluje v období mezi 30 až 50 h, s výhodou me i 30 a 35 h na koncentrací 35 mg.m 1 s jejím snmovolným násle ným poklesem na hladinu 15 až 22 mg.m 1- v období mezi 45 a 50 h kultivace při součnsném udržování hladiny gonných iontů mezi 0,35 a 0,45 mg.m 1- . Rešením se dosáhne zrychlení kinetiky tvorby chlortetracyklinu o cca 5a prodloužení lineárního přfrůstku učinné látky až do 130 h. Kromě absolutníhc zvýšení obsahu chlnrtetracyklinu ve vyfermentovaně půdě se dosáhne úspory materiálních a energetických nákladů.CS 267 807 B 1 -1 Vynález se týká způsobu kultivace Streptomyces aureofaciens s využitím znalosti fyziologické aktivity kultury počínaje ovlivněním způsobu prípravy produkčního mědia a následnou optimalisaci hladin základních substrátů při biosyntěze cblortetracyklinu.Při biosyntetické přípravě chlortetracyklinu v průmyslovém měřítku se využívá analytických údajů 0 koncentraci anorganického fosforu, sacharosy a anorganického dusíku, koncentraci produktu, pH a sterilitě. Koncentrace fosforu, sacharosy a dusíku se v půdě udržují v empiricky stanovených rozmezích dšvkováním roztoků těchto živin. Fermentory jsou vybaveny fíxním převodem otáčok, kapacita zâsobníků pro dávkování příkrmů je omczena a tím i možnost ovlivnění výrobního procesu bioinženýrskými zásahy a opatřeními. Tato situace byla důvodem pro radikální změnu prístupu k optimalizaci biosyntetického procesu a znamenala zahájení pršce na dpravě biosyntézy 3 maximálním možným stupněm porozumění fyziologii produkčního kmenev daném geometrickém uspořádání výrobní aparatury.Regulačními aspekty fermentace chlortetracyklínu se již v minulosti zabýval J. Zelinka/Biolőgia 23, l 69, 1968/. J. Šimuth a kol. se zaměřuje na syntézu nukleotidů a aktivitu RNA polymerázy v období tvorby chlortetracyklinu produkčním kmenem Streptomyces aureofaciens/J. of Antibiotics, 32, l, 53, 1979/. Bnzymatickým vybavením produkčních kmenů při biosyntěze penicilinu se v závěrečné zprávě úkolú OPTR K-02427901 zabývala Matelová a kol. /1985/. Sleduje tvorbu proteáz a amyláz v souvislosti se áožením kultivačního média. U kmenů pro které byla vhodnějším uhlíkatým zdrojem sacharoza, potvrdila ochotnou utílizaci škrobu a zvýšenou tvorbu amyláz. Běhal a kol. uvádí, že syntěza enzymů sekundárního metabolismu je reprímovéna a musí být dereprimována. Jeden z faktorů vedoucích k derepresi je vyčerpaní snadnoZ předloženěho krátkěho líterárního přehledu vyplývá, že kinetika biosynthézy chlortetracyklinu je ovlivnována fyziologickým stavem kultury a enzymatićkou výbavou kmene vycházející z historie každé jednotlivé budky a dostupnosti jednotlivých substrátů. V tomto smyslu jsme provedli zkoušky související s testovánim vlivu koncentrace jednotlivých složek produkční půdy na produkci antibiotika. Bylo např. zjištěno, že snížcním počáteční vsádky sacharosy v produkční půdě nedojde k rychlejší derepresi enzýmů sekundárního metabolismu/např. ATC oxygenázy/ po jejím spotřebování v souvislosti s možností zvýšit produkci chlortetracyklinu. Optimalizací procesu biosyntézy je třeba pojímat v komplexnějším pohledu než je empirické ovlivdování koncentrace jednoho ze substrátů ve vztahu k aktivitě enzymu a pro dukci účinné látky.Uvedené nevýhody odstraňuje způsob optimalizace vnějších kultivačních podmínek podle vynâlezu, jehož podstata spočívá v tom, že při přípravě produkčního média se uviní z kukuříčného extraktu větší množství aminokyselín, zejména basických, které zmenší hodnotu bezrozmčrněho poměru CN již na počátku růstové fáze. Vypracováním semikontinuálního dávkovacího režimu sacharőzy se dosáhne toho, že se zvýší aktivita enzymů sekundárníbo metabolismu. Při kultivaci Streptomyces aureoťaciens se hladina sacharčzy reguluje v období mezi 30 až 50 h na koncentraci 35 mg.ml 1 s jejím samovolným následným poklesom na hladinu 15 až 22mg.ml-1 v období mezi 45 a 50 h kultivace při současném udržování hladiny amonných iontůPostup podle vynálezu řeší způsob příprnvy produkčního média pro biosyntězu chlortetracyklinu ve dvou etapšch - počáteční příprava a dprava kukuřičného extraktu kyselou hydrolýzou na jednotné pH 3,9 až 3,7 s následnou suspendací všech ostatních složek živné půdy. Tímto způsobem se zvýši dostupnost některých aminokyselín zejména prolinu, sarinu, valinu,izoleucinu, tyrozinu, fenylalaninu, lyzinu a argininu pro produkční mikroorganismus. Podle analytických dat byl vypracován profil bezrozměrněho poměru CN zdrojů ve vztahu k rychlosti tvorby chlortetracyklinu s tím, že podmínkou jeho tvorby je vyčerpání anorganickěho fosforuz media. Ukázalo se, že v období ukončení exponenciálního růstu kultury v cca 30 h kultivace,kdy dochází ke konečnému konstituování komplexu enzymú sekundärního metabolismu a kdy též vrcholí specifickú aktivita lipáz a protedz je důležité zvýšit koncentraci dostupnéhn uhlíkatěho substrátu V médiu, resp. udržet její hladinu na stabilní koncentraci v krátkodoběmPostup dle vynâlezu řeší dále udržování poměru CN v průběhu biosyntézy tim způsobem,že využívá znalosti vlivu hladiny sacharozy na dosažení maximální produkce chlortetracyklinu a překonává tak dosud tradovaný a ve výrobě zavedený způsob konstentního přikrmování pro dosažení vyrovnaného profilu koncentrace po celou dobu trvání produkční fáze procesu. Spolu s vyčerpáním snadno dostupných aminokyselín, amonných iontů, rychle utilizovatelných zdrojů uhlíku při kulminaci exponenciálni fáze kultury, dochází k přesmyku na tzv. sekundární metabolismus, kdy hraje velkou důležitost enzymatická výbava kmenů. V tomto obdobi procesu kolem 30. h kultivsce není důležité nahromadit maximální množství biomasy, ale získat cca 50 celkového množství biomasy s maximální enzymatickou aktivitou. Dodrlení tohoto nárůstu mycelia odpovídajícího cca 20 sedimentu se též příznivě projevf nejen v rychlosti tvorby antibiotika, ale je též zárukou dostatečně dodávky kyslíku k rostoucím bunkámv dané geometrii míchání ve výrobním měřítku.Při postupu podle vynálezu se využívá poznatků z předchozích výpočtů, analýz a zkoušek a hladina 35 mg snharozy.ml 1 se udržuje na krátkodobém plato v období mezi 30. a 50. kultivační hodinou podle fyziologickě aktivity mycelia. Bylo zjištěno, že semikontinuální dávkování amoniakćlniho dusíku stimuluje biosyntězu chlortetracyklinu, pokud je zahájeno až ve výše zmíněném období bioprocesu, po dokončení hlavní růstově fáze kolem 30. hodiny. Tím nemůže dojít k popsané katabolické represi biosyntézy chlortetracyklinu rychle utilizavatelnými amonnými ionty. Podobný význam z pohledu utilizace rychle dostpného sacbaridického zdroje má další průběh procesu, kdy se koncentrace sacharőzy nechá samovolně klesnout na 15 až 22 mg.ml 1 v období mezi 45. a 50. hodinou kultivace. Ukázalo se, že tato opatření se positivně projeví ve fyziologickém stavu mycelia v tom smyslu, že zvláštê v závěrečném období biosyntézy nedochází k částečně autolýze mycelia a přírůstek produkce je lineární i po 10 až 20Tekutý kukuřičný extrakt je v hmotnostním množství 0,5 suspendověn v rozmíchaci nádržia technickou kyselinou sírovou upraveno pH za stálého michání na 3,9 až 3,7. Po 0,5 až 0,75 h promíchávéní jsou suspendovány ostatni základní C-,N- a P- složky média podle výrobniho předpisu. Po provedení sterilizace a očkovšní produkční půdy kulturou Streptomyces aureofaciens provádí se průběžná analytické kontrola hladiny anorganickěho fosforu, saeharozy,amonných iontů, měření a regulace pH, měření koncentrace C 02 na výstupu vzduchu, stanovení aktivity proteáz a lipáz, stanovení obsahu biomasy a rychlosti tvorby produktu. Z těchto Édajů jsou prováděny syntetické výpočty rozhodujicí pro optimalisaci vnějších podmínek při biosyntěze chlortetracyklinu. Pro dosaženi zvýšeného výtěžku chlortetracyklinu a při prodlouženěm procesu je v období mezi 30. až 50. h kultivace, s výhodou mezi 30. až 35. h udržována zvýšená hladina sacharőzy na koncentraci 35 mg.ml 1 s jejím samovolným poklesom na hladinu 15 až 22 mg.ml-1 V obdobi mezi 45. až 50. h kultivace při současn 6 mhdržování hladiny amonných iontů mezi 0,35 až 0,45 mg.ml 1. Následná zpracování vyfermentoveně půdys větším obsahom učinně látky vede k získání technického produktu až s 15 obsahem učinně látky.Tekutý kukuřičný extrakt je v hmotnostním množství 0,5 suspendován v rozmichocí nádrži a technickou kyselinou sírovou dojde k úpravě pH za stáláho míchéní na konečnou hodnotu 3,9 až 3,7. Tato suspenze se nechá míchat cca 1 h, poté se přidají ostatní ingredience a provede se sterilisace kultivnční půdy s inokulací produkční kulturou Streptomyces aureo CS 267 S 07 B 1 -3 faciens v cca 10 objemověm množství. Po dobu růstově fáze je v několika dávkách přidán tekutý kukuřičný extrakt V celkovém hmotnostním množství 0,1 tak. aby byla do 30. h žískána biomasu s vysokou cnzymatíckou aktivitou. Režim dávek je.vo 1 en tím způsobem, aby od 24. do 30. h kultivace byla hladina nnorganického dusíku nulová. Po přesmyku na produkční fázi procesu je udržována zvýšená hladina sacharőzy v období mezi 30. až 35. h na koncentrací 35 mg.m 11 a poté je přítok snadno dostupněho uhlíkatého zdroje zastaven. Pa samovolném poklesu koncentrace sacbarőzy na hladinu 15 až 22 mg.m 1-1 je obnoveno její dávkování spolu s regulací hladiny amonných iontů v biosuspenzi. Zlepšený fyziologický stav kultury umožní pro dloužit biosyntézu do 130. h při zachování produkční rychlostí.Tekutý kukuřičný extrakt je V hmotnostním množství 0,5 Ž suspendován v rozmíchacínádrži a po úpravě pH na 3,9 už 3,7 je 1 h míchén. Poté jsou suspendovány ostatní složky média a stopové prvky s tím, že u saeharőzy a síranu amonného je znížena vsádka surovín o 15 Ž. Při zachování poměru CY tak dojde k dřírějšímu vyčerpání snadno dostupných substrátů a k rychlejší derepresi enzymů sekundárního metabolismu. V průběhu kultivace je po dokončení exponenciální fáze růstu udržováno krátkodobé platő na 35 mg.m 1 l koncentrace sacharőzy s následujícím samovolným poklesem nn hladinu 15 až 22 mg.ml-1. Dosažení vyšší výtěžností ve fermen taci má za následek zlepšení kvality fínálního produktu v chemické části výrobyý

MPK / Značky

MPK: C12P 29/00

Značky: aureofaciens, výrobu, streptomyces, kultivace, způsob, chlortetracyklinu, kmene, produkčního

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/5-267807-zpusob-kultivace-produkcniho-kmene-streptomyces-aureofaciens-pro-vyrobu-chlortetracyklinu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Způsob kultivace produkčního kmene Streptomyces aureofaciens pro výrobu chlortetracyklinu</a>

Podobne patenty