Polysírový ester glykosaminoglykanu, resp. jeho sodná sůl a způsob výroby těchto látek

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Polysírový autor glykosaminoglykanu, respektive jeho sodnú aůl154) a způsob výroby těchto látek(57) Řešení se týká polysírového esteru glykosaminoqlykanu, resp jeho sodné soli,významného léčiva s antiartrotickým a chondroprotektivnim účinkem. Rovněž se týká zpúsobu výroby tohoto léčiva, a to frakcionací tzv. S-heparinu etanolem, čímž se ziská žádaná substánce, charakterizovaná rozpětim molekulové hmotnosti od 7 000 do11 000 daltonů, obsahom síry od 7 do 14 hmot. a antikoaqulační účinnosti do 90 IU/mg.Vynález se týká polysírového esteru glykosaminoglykanu, resp. jeho sodné soli a způsobu výroby tohoto esteru, resp. jeho sodné soli.Tato nová látka, v dalším označované pro struěnost heparon, má význam jako léčivo s antiarthrotickým a chondroprotektivním účinkem. Získa se z polysacharidu, odpadajícího při výrobě heparinu z hovězích plic, který má nízký obsah síry a je dodateěně sulfatován chemickou cestou a je znám pod označením S-heparin jako účinné antikoagulans. Tento sulfatovaný polysacharid se vyznačuje širokým rozmezím molekulové hmotnosti. Etanolovou frakcionací se z S-heparinového komplexu oddělí heparon, sulfatovaný polysacharíd s relativně nízkou průměrnou molekulovou hmotností a žâdoucí nízkou antikoagulační účinnosti. Zbývající frakce S-heparinu po oddělení nízkomolekulárního heparonu se tím naopak úměrně obohatí na antikcagulační účinnosti. Vynález tedy v důsledku prakticky bezztrátové technologie poskytuje nový typ žádaného léčiva a tím inovuje a značnou měrou i ekonomizuje celou výrobu heparinu a S-heparínu, jak je podrobněji popsáno níže.Jak je známa, charakterizuje E. Jorpes v monografií Heparin in the Treatment of Thrcmbosic, Oxford Press, 1946, přirozený heparin syntetizovaný organismem savců, jako nehomogenní směs mono~ až tetrasírových esterü polysacharidu (s obsahem síry 6,36 až 15,81 hmot.),uvažuje-li se disacharidová jednotka jako základ heparinové makromolekuly. vedle této směsi sírových esterů existuje v organismu ještě síry prostý heparinový polysacharid, konjugát uranové kyseliny s glukosaminem. Úměrně se zvyšujícím se obsahem síry stoupá antikoagulační účinnost, síry prostý polysacharid je antikcagulačně neúčinný. Průměrné molekulová hmotnost heparinu s převahou podílu výše sulfatovaných esterů je asi 16 000 daltonú.Při výrobě heparinu z hovězích plic (čs. pat. spis č. 91 903) se získá jednak frakce obsahující vysoce účinný heparin a jednak frakce polysacharidú s nízkym obsahem síry a nízkou antikoagulační účinnosti, která tvoří odpad. Podíl této frakce je asi 6 až Bnásobek hmotnosti čistého heparinu.Uvedenou odpadní polysacharidovou frakci se podařilo výhodně zužitkovat dodatečnou chemickou sulfatací na antikoagulačně účinný produkt (čs. AO č. 217 193). Z výchozí suroviny,tj. z odpadní frakce s obsahem síry pod 3 hmot. se tak získal produkt s obsahem síry až 13 hmot., analogický heparinu a s antikoagulační a antilipemickou aktivitou srovnatelnou ~s čistým heparinem. Tento produkt, v dalším označovaný pro stručnost S-heparin, byl zaveden do léčebné praxe jako účinná součást externé aplikovaných přípravků k léčení trcmboflebitidy,hematomů apod., popřípadě sublinguálních tablet s antilipemickým účinkem.Výsledkom dalších výzkumů v této oblasti bylo zjištění, že S-heparin, definovaný jako polysulfát glykosaminoglykanu (GAGPSJ, je z hlediska molekulové hmotnosti směsí frakcí asi od 5 000 do 17 000 daltonü, přičemž stupeň sulfatace je téměř rovnoměrný bez ohledu na velikost polyméru. Tento poznatok vedl k vypracovaní postupu izolace určitých frakcí s poměrně úzkym rozpětím molekulových hmotnosti a umožnil tak získat materiály s různými biochemickýmia farmakologickými vlastnostmi. Jednouz látek takového typu je frakce S-heparinu s molekulovouhmotností pod 11 000 daltonů a s obsahem síry 8 až 14 3 hmot. Způsob frakcionace S-heparinu,vedoucí k izolací jmenované frakce, označovaná jako heparon (viz výše), jsou předmětem tohotosvými vlastnostmi patří heparon mezi antiarthrotika, resp. chondroprotektiva, kterájsou používána k léčení artrozy kyčelních a koleních kloubů, ďegenerativních onemocnění páteře, bolestivé ztuhlosti kloubů apoü. Přesná chemická struktura heparonu není určitelná,nebot GAGPS jsou aniónické heteropolysacharidy, složené z konjugovaných hexuronových kyselín a aminocukrů. Charakteristickými rysy jsou relativně vysoký obsah síry a definované rozpětí molekulové hmotnosti.Při studiu vlastností a biologické účinnosti byl heparon srovnáván s komerčním přípravkem z téže indikační oblasti (IX. Europäischer Kongrese für Rheumatologie, Wiesbadeu, 1979,Antiartrotický a chondroprotektivní účinek ÉAGPS je výsledkom celé řady jejich nespecifických i specifických interakcí. Příkladem nespecifického působení je inhibice proteoly řtických enzymů, které jsou nejvýraznějším faktorem degradace základní hmoty kloubní chrupavky.Jde zejména 0 kolagenázy a neutrální proteinázy serinového a thiolového typu. Příkladem specifického působení heparonu je kompetitivní inhibice beta-glukuronidázy, která se podílí na rozkladu polysaoharidových řetězců proteoglykanů chrupavky. Specifícká složka antiartrotického účinku heparonu se projevuje zejména přímím ovlivněnúnartrotických chondrocytů ve smyslu narušeného metabolismu a zvýšení biosyntézy kolagenu a proteoglykanů.Inhibice hydrolytických enzymů in vitro heparonem ve srovnání s komerčním přípravkem byla s pomocí příslušných substrátů prokázána u kolagenázy, elastázy, katepsinu B 1, papainu, chymotrypsinu a beta-glukuronidázy. Inhibice všech testovaných proteináz měla u obou látek velmi podobný průběh, přičemž 50 8 inhibice proteolytických enzymů bylo dosaženo při koncentracích 107 molárních, které odpovídají hladinám in vivo, jakých je dosahováno v lidské artrotické chrupavce i po nitrosvalové aplikaci komerčního prípravku.Při studiu vlivu heparonu a komerčního přípravku na metabolismus kolagenu a proteoglykanů lidské osteoartrotickě chrupavky in vitro byly jako radíoaktivní prekurzory použity D-l(14 C)-glukosamin a L-(5-3 H)-prolin. V kolagenní frakci byl stanoven hydroxyprolin a izolován 3 H-hydroxyprolin. Z frakce proteoglykanové byly izolovány proteoglykany a stanoven obsah bílkovin, hexosaminu a zjíšřována radioaktivitat 140-glukosaminu a 3 H-prolinu jako míra inkorporace radioaktivních prekurzorü do bílkovinné a polysacharidové složky proteoglykanú. Ze získaných výsledků vyplynulo, že v přítomnosti obou preparátů se výrazně zvýšila inkorporace radioaktivních prekurzorů do kolaqenní a proteoglykanové (bílkovinné í polysacharidové) frakce osteoartrotioké chrupavky o 40 až 100 I. Tento jev byl už popsán a detailně studován řadou autorů (již citováno). Bylo prokázáno, že GAGPS obecně jednak inhibují katabolické procesy chondrocytů V chrupavce a jednak přímo stimulují biosyntézu proteoglykanü a kolagenu těmito chondrooyty. Celkový účinek se tak projevuje normalizací metabolické aktivity chondrocytů a tento děj je jedním z nejdůležitějších předpokladů antiartrotické a chondro protektivní účinnosti GAGPS a tedy heparonu in vivo.Dále bylo pomocí znaěeného 99 Tc-heparonu a komerčního prípravku sledováno rozdělení radioaktivity v různých tkáních krys ve 24 hodině po nitrosvalové aplikaci. Významné z terapeutického hlediska je zjištění vysokých koncentrací vkloubní tkáni V blízkém soúsedství místa aplikace, přičemž rozdíly mezi bběma přípravky jsou statisticky nevýznamné.Podle vynálezu lze tedy heparon charakterizovat jako polysírový ester glykosaminoglykanu(GAGPS) resp. jeho sodnou sůl, obsahující 8 až 14 hmot. síry, nejvýše 3 hmot. dusíku,s molekulovou hmotnosti Mr 7 000 až 11 000, 5 antikoagulační účinnosti nejvýše 90 IU/mg(vyšší účinnost je nežádoucí z důvodů vedlejších účinků).Vynález se dále týká způsobu výroby polysírového esteru glykosaminoglykanu - heparonu - a jeho sodnésoli. Podstata tohoto způsobu spočívá V tom, že se vodný roztok S-heparinu o hmotnostní koncentraci 4 až 5 , s přísadou 1 hmot. chloridu sodného, s hodnotou pH 6 až 9, při teplotě 10 až 20 °C, sráží organiokým, s vodou mísitelným rozpouštědlem, zejména etanolem,do koncentrace 27 až 32 obj., po oddělení vyloučené sraženiny 1 frakce se supernatant při teplotě 10 až 20 °C sráží organickým, s vodou mísitelným rozpouštědlem, zejména etanolem,do koncentrace 50 až 60 obj., vyloučená sraženina 2 frakce se po oddělení a dehydratací rozpustí ve vodě na roztok o hmotnostní koncentraoi 8 až 12 , s přísadou 1 hmot. chloridu sodného, jenž se po úpravě pH na hodnotu 9 až 10 při teplotě 70 až 100 OC odbarvuje působením manganistanu sodneho v množství 0,5 až 1 hmot., vztaženo na hmotnost 2 frakce, vyloučená sraženina se oddělí z filtrátu po ochlazení na teplotu 15 až 25 °C přidáním organického S vodou mísitelného rozpouštědla, zejména etanolu, nejméně ve dvojnásobném objemovém přebytkuj vyloučená 2 frakce se po izolací rozpustí ve vodě na roztok o hmotnostní koncentraci20 OC, k němuž se přida organické, s vodou mísitelné rozpouštědlo, zejména etanol, do koncentrace 27 až 32 ohj., popřípadě vzniklé sraženina se oddělí a spojí s 1 frakcí, načež seze supernatantu zvýšením koncentrace organického, s vodou mísitelného rozpouštědla, zejména etanolu, na 50 až 60 obj., vyloučí žâdaný produkt heparonu ve formě sraženiny, která se izoluje.Získané substanoe sodné soli heparonu, jako definovaná frakce GAGPS, je bílý amorfní prášek, rozpustný ve vodě, nerozpustný v organických rozpouštědleoh, netaje, rozkladá se. K průkazu totožnosti slouží metachromatická reakce s toluidinovou modří, která je charakteristická pro GAGPS. Obsah dusíku dle Kjeldahla je nejvýše 3 B hmot. v sušině, obsah síry dle Schöniqera minimálně 8 S hmot. v sušině, antikoagulační účinnost nejvýše 90 IU/mg. Molekulová hmotnost, Mr, stanovená gelovou permeační chromatografií je 7 000 až 11 000. K léčebným účelüm se heparon aplikuje injekčně v podobě 5 E vodného roztoku (váhově) a to nitrosvalově nebo nitrokloubně V 15 individuálních dávkách po 1 ml v průběhu 8 týdnů. Léčebné kůry se mohou po 6 měsících opakovat.vynález je blíže ilustrován následujícím příkladem provedení, přičemž ovšem není omezen pouze na podmínky v něm uvedené.1 kg S-heparinu z hovězích plic a 200 g chloridu sodněho se za míchání rozpustí ve 20 litrech demineralizovaně vody a pH vzniklého roztoku se upraví 20 roztokem hydroxidu sodného na pH 8. za stáleho míchání se při teplotě do 20 °C přidává etanol do koncentrace 27 až 30 S obj. V míchání se pokračuje ještě 10 minut a pak se nechá v klidu 24 hodin sedimentovat. Potom se supernatant oddělí a sražsnina (1 frakce) se zpracuje na antikoagulačně vysoce účinný přípravek - S-heparin se zvýšenou antikoagulační účinnosti.Ksupernatantu po oddělení 1 frakce se za stálého míchání při teplotě do 20 °C přidává etanol do koncentrace 55 až 58 obj. a po 10 minutách míchání se odstaví na 48 hodin k sedimentaci. Supernatant je odpad a získaná sraženina 2.frakce se dehydratuje etanolem, filtruje a suší.100 g 2.frakce a 10 g chloridu sodného se rozpustí v 1 litru destilované vody, pH roztoku se upraví 20 roztokem hydroxidu sodného na 9 až 10, zahřeje se na vodní lázni na 80 °C a přidá se 1 g manganistanu sodněho. Roztok se za občasného zamíchání udržuje 30 minut při 80 OC. vylučuje se voluminezní halastní sraženina hydratovaného oxidu manganičitého, nad kterou se odděluje čirý, prakticky bezbarvý roztok. Filtrací za horka přes asbestovou filtrační vložku se sraženína oddělí a promyje na filtru malým množstvím horkého 1 roztoku chloridu sodného. Filtrát se ochladí pod 20 DC a pomalým litím do pětinásobného objemu etanolu se vysráží produkt jako bílá dobře sedimentující sraženina. Supernatant se cdcáhne do odpadu a sraženina se dehydratuje etanolem, filtruje a suší.100 g tohoto produktu se rozpustí ve 2 litrech destilované vody s 20 g chloridu sodného a pH se upraví na 8. za stálého míchání se přidává etanol až do koncentrace 30 obj. Pokud se tvoří nějaká sraženina, nechá se 24 hodin sedimentovat, zpracuje dehydratací a sušená se spojí s 1 frakcí. Ze supernatantu se dalším zvýšením koncentrace etanolu až na 60 5 obj. vysráží heparonová frakce jako konečný produkt. Po sedimentaci asi 24 hodin se sraženina dehydratuje etanolem, filtruje a na filtru promývá absolutním etanolem, eterem a suší nejprve volně a potom v exsikátoru.Hmotnostní výtěžek konečného produktu, tj. heparonu, je asi 10 až 20 hmotnosti výchozí

MPK / Značky

MPK: C07H 11/00

Značky: způsob, ester, sodná, resp, těchto, polysírový, výroby, glykosaminoglykanu, látek

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/5-265558-polysirovy-ester-glykosaminoglykanu-resp-jeho-sodna-sul-a-zpusob-vyroby-techto-latek.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Polysírový ester glykosaminoglykanu, resp. jeho sodná sůl a způsob výroby těchto látek</a>

Podobne patenty