Způsob zpracování krevní plasmy a její frakce

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

(75) Autor vynálezu RYBÁK MIROSLAV ing. csc., ČOUPEK JIŘÍ ing. CSc., ULRYCH STANISLAV RNDr., LOŠTICKÝ CYRIL RNDr. csc., SEDLMAIER OLDŘICH, PRAHA(54) Způsob zpracovávání krevní piazmy na její frakceŘešení se týká zpüsobu zpracování lidské nebo zviřecí krevní plazmy nebo jejich frakci na koncentráty antitrombinu III, proteínu C, koagulačnich faktorů a dalších bílkovin, a to afinitni sorpci na ekvilibrovaném polymernim nosiči s imobilizovaným heparinem a následující selektivni desorpcí, přičemž sorpce z výchozi suroviny se provádí na makroporéznim sférickém sorbentu na bázi kopolymerů hydroxyalkylakrylátů nebo hydroxyalkylmetakrylátů se 2 až 4 atomy uhliku V alkylovém zbytku. Řešení všestranné zlepšuje a ekonomizuje společensky významnou výrobu derivátů krevni plazmy.Vynález se týká způsobu zpracování lidské nebo zvířecí krevní plasmy nebo jejich frakcí na koncentráty antitrombinu III, proteinu C, koagulačních faktorů a dalších hílkovin, afinitní sorpcí na ekvilibrovaném polymerním nosiči s imobilizovaným heparinem a následující selektivní desorpcí. Tyto složky krevní plasmy v podobě více či méně čistých koncentrátů jsou důležité při laboratorní diaqnostice hemokoagulačních poruch, slouží k přípravě preparátů pro klinickou aplikaci a slouží k přípravě antigenů za účelem produkce antisér, proto jejich separace a purifikace má značný význam.Využití lidských krevních hílkovin pro klinické účely je znesnadněno nebezpečím přenosu sérové hepatitídy, případně i choroby AIDS, pokud bílkovinu nelze zahřívat 10 h na teplotu 60 °C, dále pak komplikovaností a nízkou efektivností konvenčních preparačních metod. Řešení těchto problémů se nabízí V použití separačních postupů na bázi afinitní sorpce a desorpce. Tato cesta je jednoduchá, vysoce selektivní a hospodárná a umožňuje vycházet i z malých objemu a používat jen plasmy s negativním nálezem antigenu sérové hepatitídy, což redukuje nebezpečí přenosu viru na minimum. Vzhledem k poměrně stabilitě antitrombinu III v přítomnosti stabilizátorú je dána možnost, aby byl zahříván 10 h na teplotu 60 °C bez podstatné ztráty aktivity. stupeň určité purifikace je však podmínkou. Separaci uvedených bílkovin lze zařadit před schéma běžné průmyslové frakcionace krevní plasmy, aniž by tím byl nějak porušen frakcionační postup a výtěžky albuminu auminoglobulinů.Antitrombin III je inhibitor trombinu,koaqu 1 ačních faktorů Xa, XIIa, Xľa a dalších proteínáz krevní plasmy a tělních tekutín. V krevním oběhu cirkuluje ve své neaktivní formě a je aktivován účinkem heparinu a látek heparinu podobných. Separovaný a koncentrovaný antitrombin III, at již ve své proformě neho vpodobě aktivního komplexu s heparinem, upravený do vhodné aplikační formy, může být léčebně a preventivně použit při suhstituci dědičného či získaného nedostatku antitrombinu III a při mnoha dalších indikacích. Antitrombin III je dále potŕebný pro stanovení hladiny heparinu a proteínu C v krevní plasmě, při monitorování heparinu během mimotělního obehu apod.Protein C je jedna z plasmatických proteináz přítomná v plasmě v neaktivním stavu a aktivovaná trombinem za spoluúčaeti endoteliálního trombomodulinu. Jeho fyziologický význam spočíva v tom, že inaktivuje koaqulační faktory V a VIII a aktivuje fibrinolýzu, čímž ovlivñuje proces krevní koagulace. Koncentráty proteínu C jsou potenciálni antitrombotika s podobnou indikací jako antitrombin III (hyperkoagulační stavy).Je známa příprava antitrombinu III s použitím afinitní sorpce na polysacharidových nosičích. Tyto nosiče však mají řadu nedostatku, například náohylnost k bakteriální kontaminaci s následnou produkcí endotoxinů-pyrogenů, ke změně vlastností nosiče a zhoršení průchodnosti sloupce, dále špatnou odolnost proti fyzikálně-chemickým podmínkam, malou životnost apod.Bylo zjištěno, že sorbenty na bázi syntetických polymerů hydroxyalkylakrylátú a hydroxyalkylmetakrylátú uvedené nedostatky odstraňují. Nazákladě těchto nových poznatků byl vypracován způsob zpracování lidské nebo zvířecí krevní plasmy na koncentráty antitrombinuIII,proteínu C, koagulačních faktorů a dalších bílkovin, afinitní sorpcí na ekvilibrovaném polymerním nosiči s imobilizovaným heparinem a následující selektivní-desorpcí, podle vynálezu,jehož podstata spočíva v tom, že se sorpce výchozí suroviny provádí na makroporézním sférickém sorbentu na bázi kopolymerů hydroxyalkylakrylátů a hydroxyalkylmetakrylátů se 2 až 4 atomy uhlíku v alkylovém zbytku, obsahujícím imobilizovaný heparin.Podle potřeby nebo podle možností lze sorpci výchozí suroviny na sorbent provádět bud na sloupci nebo vsádkově. Pro dosažení optimálního účinku je výhodné používat sorbent s velikosti částic od 50 do 300 pm.Výhodné fyzikálně-chemické vlastnosti sorbentů na bázi hydroxyalkylakrylátů a hydroxyalkylmetakrylátů podstatne zlepšují možnost komplexního zpracování lidské nebo zvířecí plasmynebo plasmatických frakcí na žádané produkty. odolnost sorbentu proti vysokým tlaküm dovolujeV pracovat rychle a standardně. s přesnou reprodukcí pracovních postupů a s možností automati zaoe celého procesu. Charakter nosiče umožňuje uskutečnit průtok tekutín tlakově, dodržovat časový limit operací a optimalizovat jednotlivé operace. Stálost a trvanlivost sorbentu použitého při způsobu podle vynálezu je nesrovnatelně vyšší než u kterýchkoliv dosud známých a pro tyto účely užívaných materiálů, což má i příznivé ekonomické důsledky. Zivotnost sor~ bentu při opakovaném používání (2 až 3 cykly týdně) je několik roků. Způsob podle Vynálezu tedy podstatné zdokonaluje a ekonomizuje společensky důležitou výrobu významných derivátů krevní plasmy a zlepšuje tím i léčebnou a diagnostickou praxi.V následujících příkladech provedení je uvedeno několik možností zpracování krevní plasmy způsobem podle vynálezu. Tyto příklady však vynález pouze ilustrují, ale nijak neomezují na podmínky v nich uvedené.P ř 1 k 1 a d 1 Separace hrubé frakce plasmatiokých bílkovin s afinitou k heparinusloupec (6 x 35 cm) se předem promyje pufrem, který obsahuje 0,005 mol/1 citrátu sodného a 0,1 mol/l chloridu sodného B až 10 l lidské krevní plasmy (nebo tzv. K-plasmy) s hodnotou pH 6,0 až 6,4 se protlačuje peristaltickým čerpadlem rychlostí 50 až 60 ml/min. Sorbent s průměrnou velikostí zrna 100 až 200 pm byl před naplněním do sloupce ponechán 24 h botnat ve vodě. Proteklá plasma, ochuzená o sorbovaný podíl, se zpracuje odděleně samostatnou frakcionací na imunoglobuliny a albumin. Na sloupci je za těchto podmínek zachyceno 80 až 90 antitrombinu III. sloupec sorbentu se potom promyje výchozím pufrem a sorbované bílkoviny se z vazby na sorbent eluují jako jediný podíl pomocí citrátového pufru (0,005 mol/1) pH 7,5,který obsahuje Z mol/1 chloridu sodného. získaná hrubá frakce obsahuje antitrombin III,protein C, plasminogen, koagulační faktory a další bilkoviny. Tato frakce se po dialýze dále frakcionuje. Proces sorpce a eluce je kontrolován sledovaním koncentrace bílkovinP ř í k 1 a d 2 Příprava koncentrátu antitrombinu IIIPostupuje se jako v příkladu 1. Po sorpci a promytí sloupce se nejprve uvolní bílkoviny sorbované slabší vazbou, a to púsobením acetátového pufru (0,4 mol/1 ve vodě) s hodnotou pH 7,5. Z promývací tekutiny je získán protein C, plasminogen, koagulační faktory ev. další bílkoviny. Tato frakce se zpracuje odděleně. Po promytí sloupce nadbytkem acetátového pufru se ze sloupce eluuje zkoncentrovaný antitrombin III roztokem s vyšší iontovou silou, s výhodou citrátovým pufrem 0,005 mol/1 pH 7,5 s obsahem 2 mol/1 chloridu sodného. Eluát se odsolí a zahustí ultrafiltrací na obsah 0,1 až 0,3 hmot. a po přidání natríum citrátu (0,6 mol/1) a úpravě pH na 7,5 se roztok zahřívá 10 h na 60 °C, aby se inaktivoval popřípadě přítomný virus sérové hepatitídy. Potom se roztok zbaví citrátu diafiltrací, zahustí na koncentraci cca 50 IU/ml, přidá se 1 hmot. sorbitolu jako stabilizátoru a lyofilizuje se,čímž se získá preparát koncentrátu antitrombinu III určený pro klinickou aplikaci.P ř í k 1 a d 3 Příprava proteínu C a koncentrátu koagulačních faktorů vedle antitrombinu IIIPostupuje se jako v příkladu 1 a 2. Po sorpci a promytí sloupce výchozím pufrem se sorbované bílkoviny postupně eluují těmito pufry1. 0,22 mol/1 octanem sodným se odstraní balastní bílkoviny 2. 0,32 mol/1 octanem sodným se získá koncentrát proteínu C, který se potom zpracuje3. 0,4 mol/l octanem sodným se získá frakce bohatá na koagulační faktor X a plasminogen,která se zpracuje podle záměru použití pH ve všech případech je 7,5.4. 2 mol/1 chlorídem sodným v citrátovém pufru (0,005 mal/1, pH 7,5) se ze sloupce vytěsní antitrombin III.P ř í k 1 a d 4 Příprava komplexu nntitrombinu III s heparinemPostupuje se jako v přikladu 1, 2 nebo 3, přičemž antitrombin III je eluován heparinem(0,005 mal/l citrátový pufr pH 7,5 obsahující 100 mg heparinu v litru). Podíl obsahující antitrombin III - heparinový komplex se pro klinickou aplikaci zpracuje podle příkladu 2. Přítomnost tohoto komplexu je prokazována na základě A 285 spektrofotometricky.P ř í k 1 a d 5 Vsádkový způsob zpracování plasmyVe 21 itrové skleněné nádobě se smíchá l 000 ml lidské krevní plasmy s hodnotou pH 6,0 až 6,4 se 100 ml vlhkého sorbentu ekvilibrovaného stejně jakc v příkladu 1 a míchá se 1 h. Po usazení sorbentu se supernatant odtáhne nebo odstředí, načež se sorbent promývá a eluuje přidávánim elučních roztoků podle příkladů 1 až 4. Získané frakce se zpracují podle záměru použití. Používá se sorbent o zrnění 200 až 300 pm.P ř I k 1 a d 6 Příprava antigenu antitrombinu III (vysoce purifikovaného antitrombinu III)Sorpce plasmatických bílkovin na sloupec s ímobilizovaným heparinem je provedena podle příkladu 1. odstranění volněji vázaných bílkovin je provedeno prnmývacím roztokem (0,8 mol/l netrium acetát pH 7,5). Antitrombin III je ze sloupce eluován citrátovým pufrem 0,005 mol/1,pH 7,5 s přídavkem 2 mal/l chloridu sodnáho. získaný eluát je odsolen a koncentrován na 1/50 objemu výchozí plnsmy. Další purifikące je provedena molekulúrní filtrací. Jako antiqsnu je použito podílů s maximální apecifickou aktivitou antitrombinu III. získá se produkt vhodný k produkci monospecifických polyklonálních i monoklonálních protilátek. oba typy protilátek aloułí v diagnostice.Regenerace sorbentu se provádí citrátovým pufrem (0,0 D 5 mal/1) pH 7,5 s obsahem 2 mol/1 chloridu sodného. Tento puft je pak vymyt vodou a sloupec je naplněn citràtovým pufrem(0,005 mol/1) pH 6,0 až 6,5, čímž je sloupec připraven k dalšímu použití. Pokud není sloupec delší dobu poulíván je uchováván v citrátovém pufru (0,005 mol/1) pH 6,0 až 6,5 obsahujícím hakterioatatlkum. Před použitím sloupce je nutné tento pufr nahradit pufrem výchozím.1. Způsob zpracování lidské nebo zvížecí ktavní plasmy neho jejích frnkcí na koncentráty antitrombinu III, proteínu C, koagnlačních faktorů e dalších bílkovin, efinitní sorpcí vychozí suroviny nn skvilibrovanćm polymnrním nosiči s imobilizovaným heparinem I následující selektivní desorpcí, vyznačující se tím, in se sorpce výchozí suroviny provádí na makroporézním stérickóm sorbnntu na bázi kopolymorů hydroxynlkylnkrylátů-nebo hydtoxyelkylmetakrylátů se Z až 4 atomy uhlíku v alkylavćm zbytku.

MPK / Značky

MPK: A61K 35/16

Značky: plasmy, zpracování, krevní, její, způsob, frakce

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/5-263615-zpusob-zpracovani-krevni-plasmy-a-jeji-frakce.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Způsob zpracování krevní plasmy a její frakce</a>

Podobne patenty