Způsob stanovení fertility spermií u kanců pomocí proakrozínu

Číslo patentu: 253101

Dátum: 15.10.1987

Autori: Železná Blanka, Čechová-tomanová Dana, Šulcová Brigita

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

(54) Způsob stanovnnífertility spermií u kancú pomoci proakrozinuJe řešen způsob stanovení fertility spermií u kanců pomoci proakrozinu. Vzorek spermií se odstředěnim odděli od média a po promytí se v nich přítomný proakrozin a akrozin extrahuje 2 obj. zředěnou kyselinou octovou, načež na chromatografícké koloně s náplní sičovaného polydextranu se směs proakrozinu a akrozinu oddělí od inhibitorů, a to při teplotě 0 až 4 °C, načež se stanoví množství proakrozinu V této směsi. Metoda slouží k hodnocení kvality ejakulátů jednotlivých plemeniků se zřetelem jejich vybrání k chovu, k hodnocení nově vyvíjených postupů konzervace semene a ke kontrole dodržování určených postupů. Metodu lze uplatnit zejména u hospodářských zvířat - savců, prasat, koní, beranů apod., ale také v humánni medicíně.vynález řeší způsob stanovení fertility spermií u kanců pomocí proakrozinu.Metody v praxi používané pro určení fertility spermií jsou dosud převážně založeny na pozorovaní optickým mikroskopem. hodnotí se morfologie spermií, počet živých buněk, motilita,popřípadě přežitelnost. Je známo, že tyto metody nejsou dostatečně objektivní a proto V posledních letech jsou v literatuře uváděny snahy o biochemické testy založené na stanovení enzymatických aktivít, zvláště akrozinu (Goodpasture a kol., J. Androl. 1, 16-17 (1980), Goodpasture a kol., J. Androl. 3, 151-156 (19 E 2) Mohsenian a kol., Fertil. Steril. 37, 223-229 (1982. Nalezené korelace mezi obsahem akrozinu a fertílitou spermií však nebyly uspokojivé.,Vysoce objektivním ukazatelem poškození spermií se ukázal test proakrozinu (Čechová a kol., Andrologia 16, 169-174 (1984) roman a kol., Reprod. Fert. 70, 301-308 (1984. V podstatě je fertilita spermií v přímé koreląci s naměřenými hodnotami proakrozinu. Metoda se skládá ze tří důležitých částí, a to je extrakce spermií, dále odstranění inhibitorů akrozinu,a konečně kvantitativní stanovení proakrozinu a akrozinu.Extrakce spermií používané k vyhodnocení akrozinu či proakrozinu ve spermiích byly nákladné na čas i materiál. Prováděly se v přítomnosti inhibitorů akrozinu a detergentú, což nejsou výrobky v ČSSR snadno dostupné. vedle této nevýhody bylo měření koncentrace prcakrozinu a akrozinu prováděno V přítomnosti inhibitorů, a dosažené hodnoty byly značně zkresleny. V případě, že inhibitory a detergenty nebyly použity, byla extrakce prováděna za extrémne nízkeho pH a docházelo ke snížení hodnot proakrozinu a akrozinu. Ztrâty byly zvlášt vysoké, byly-li~testovány spermie jiných živočíšnych druhú než prasete. Extrémně kyselý extrakt bylo nutnodialyzovat a zahustit před odstraněním inhibitorů sloupcovou chromatografií.Předmětem vynálezu je způsob stanovení fertility spermií u kanců pomocí proakrozinu, vyznačený tím, že vzorek spermií se odstředěním oddělí od média a po promytí se přítomný proakrozin a akrozin extrahuje 2 obj. zředěnou kyselinou octovou, načež na chromatoqrafické koloně s náplní sítovaněho polydextranu se směs proakrozinu a akrozinu oddělĺ od inhibitorň při teplotě 0 až 4 °c, načež se stanoví množství proakrozinu V této směsi, které odpovídá ferti~ litě.Bylo zjištěno, že extrakcí proakrozinu je možno provádět při pH vyšším (2 obj. kys. octová) a přitom nedochází ke ztrátám akrozinu a proakrozinu u kančích i hřebčích spermií. Protože není nutno zařazovat před sloupcovou chromatografíí dialýzu a zahuštění vzorku, je novým způsobem extrakce podle vynálezu dosaženo časové i materiálové úspory. Touto úpravou jerovněž ulehčena manipulace a metoda je zpřesněna a zpřístupněna pro využití v praxi.Dále jsou uvedeny příklady způsobu stanovení fertility spermií pomocí proakrozinu podlevynálezu. Príklad 1 ~ stanovení fertility spermií z čerstvého kančího ejakulátuSpermie se od semenné plasmy oddělí odstředěním při 600 g, ZD min v 20 OC. Zbytky plasmy se z povrchu spermií odstraní dvojím promytím v roztoku 0,264 M sacharózy V 0,005 M mofrolinetansulfonové kyseliny upraveným 0,5 M hydroxidem sodným na pH 6,5. Objem proplachovacího roztoku je přibližně stejný jako objem usazených spermií. Spermie se V proplachovacím roztoku opatrně rozmíchají a odstředí za stejných podmínek jak bylo uvedeno pro odstranění semenné plasmy. iKe spermiím je poté přidána 2 obj. kyselina octová ve stejném objemu jako usazené spermie. Spermie se promíchají a extrahují 60 min při 4 OC za občasného zamĺchánĺ. Od této chvíle jsou všechny operace prováděny za teploty 0 až 4 OC až do měření aktivity akrozinu. Po 60 min extrakce proakrozin a akrozin přejde do roztoku a extrakt se odstředí při vysokých obrátkách,např. 13 000 g.Extrakt obsahuje přírodní inhibitory akroazinu, které znemožňují přesné enzymatické stanovení. Inhibitory se odděli od proakrozinu a akrozinu na sloupci zesičovaného polydextranu(Sephadexu G-100) o rozměru 1,4 x 28 cm stabilizovaném a eluovaném 0,001 M kyseliny chlorovodíkové. Frakce jsou sbírány sběračem frakcí o objemu 1,3 ml za 20 min. Proakrozin je eluován přibližně ve frakcích č. 10 až 20. Tyto frakce se zhodnoti na aktivitu po autoaktivaci.Do zkumavky se pipetuje 0,1 ml eluátu (stačí každá druhá zkumavka), přidá se 0,1 ml aktivačniho pufru (0,2 M Tris-(hyxroxymethyl)aminomethan hydrochlorid, dále jen Tris.) pH 8 s 0,1 M chloridu vápenatého a nechá se v místností 30 min. Pak se pýidá 2,4 ml 0,1 M Tris. pufru,pH 7,8 s 0,025 M chloridu vápenatého a poté 0,1 ml substrätu (1 mg N-benzoy 1-D,L-arginin-P-nitroanilid v 0,1 ml dimetylformamidu) a vše se nechá 15 min reagovat při teplotě mistnosti(20 až 26 °C). Reakce se zastaví přidáním 30 kyseliny ootové. Hodnoty se proměří na spektrofotometru či kolorimetru oproti blanku, který je připraven stejně jako vzorek s tim rozdilem,že misto eluátu z kolony se přidá stejný objem 0,001 M kyseliny chlorovodíkové. Frakce ukazujĺcí zvýšenou absorbanci qžluté zsbarvení) se spojí a ve spojené frakci, dále jen frakci, se změři celková aktivita akroazinu před autoakvivaci.Do 3 ml křemenných skleněných kyvet se pípetuje 2,8 až 2,85 ml 0,1 M Tris pufru, pH 7,8 s 0,025 M chloridu vápenatého, přidá se 0,1 ml substrátu a do směsi po vytemperováni na 25 °C se pipetuje 0,05 až 0,10 ml frakce. Celkový objem reakčni směsi je 3 ml. Změna absorbance při 405 nm se měři při 25 °C na spektrofotometru či kolorimetru nejlépe pomoci zapisovačs. Naměřené hodnoty se vyjádří V jednotkách.Poté se stanoví celková aktivita akroazinu po autoakvivsci. Ve zkumavce se smichá 0,4 ml spojené frakce s 0,4 ml akvivačního pufru pH 8,0 a směs se nechá aktivovat při 25 °C 30 min. Poté se odebere z aktivované směsi vzorek 0,1 až 0,2 ml a měři se aktivita akroazinu jako V předešlém odstavci (aktivita akroazinu bezvautoaktivace).Hodnota před aktivaci se odečte od hodnoty po aktivaci a získaná hodnota odpovídá obsahuproakrozinu. Provede se srovnání se známými hodnotami maximálniho možného obsahu proakrozinu V miliardě spermií a vyjádří se procentuální zastoupení neporušených (tj. plodných) spermií v ejakulátu.stanovení fertility spermií konzervovaných v ŕedidlechŘedidlo se odděli od spermií postupem stejným jak je uvedeno u přikladu 1 a také další postup je stejný.P ř i k 1 a d 3 stanovení fertility spermií z mražených dávekZmražené dávky se rozmràzi stejným způsobem, jako se provádí jejich rozmraženi před inseminací. Ředidlo se odstrani centrifugaci a dále se postupuje jak je uvedeno u příkladu 1.P ř I k l a d 4 stanovení fertility spermií z čerstvého ejakulâtu hřebcůPostupuje se postupem jako u příkladu 1 s tím rozdílem, že autoaktivace proakrozinu vespojené frakci se provádí 1 hodinu místo 30 minut.Dále je uvedena srovnávací tabulka, z které vyplýva vysoká objektivita této metody veSrovnávání hudnot proakrozinu a testu přežitelnosti v procentech u kančich spermií uchovávaných po 4 dny v různých ředidlechMikroskopicky Ředidla Proakrozin zjištěná přežitelnost Q PL 69 50 ZOR 94 15 SAD O 70 BL-M O 50složení glukqsa monohydrát 60,0 g citronan sodný x 2 H 20 3,7 g NaHC 03 1,2 g kyselina etylendiamintatraoctová 3,7 g dihydroatreptomycin sulfát 0,8 g penicilin-D-natrium 0,3 g voda bidest. 1 000,0 cm 3ZOR (Gottardi a kol., Abstr. 9 th Congr. on Anim. Reprod. and Artif. Insem., Madrid. 1980, III, s. 275) zorlesco medium - podle Gottardi a kol. (1980) složení D-glukosa 63,75 mM N 33-citrát 39,65 mM NBHCO 3 20,81 mM EDTA - Naz , 6,35 mM TRIS 53,65 mM kyselina cítronová 19,57 mM Bovíne Serum Albumin 5,00 hmot./obj. Cystein 0,45 mM Neomycin sulfát 1,00 hmot./obj.složení glukosa bezvodá medícinální 51,00 g citronan sodný neutrální x 2 HZD 1,52 g NaHC 03 0,5 g Chelaton 1,6 g vaječný žloutek 3,0 Streptomycin 0,5 g Pênicilin 6 500 000 MJ voda bidest. 1 con cm 3složení glukosa bezvodá medicinálni 29,0 g citronan sodný neutr. x 2 H 20 10,0 g NaHC 03 2,0 g sulfanilamid 0,3 g vaječný žloutek 3,0 3 Streptomycin 0,5 g Penicílin 6 500 000 MJ

MPK / Značky

MPK: G01N 33/50, C12Q 1/00

Značky: stanovení, spermií, kanců, fertility, proakrozínu, způsob, pomocí

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/5-253101-zpusob-stanoveni-fertility-spermii-u-kancu-pomoci-proakrozinu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Způsob stanovení fertility spermií u kanců pomocí proakrozínu</a>

Podobne patenty