Kmeň mikroorganizmu Acremonium chrysogenum

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Amr nam MARTVOŇ AUGUSTIN doc. ing. CSc. , BRATISLAVA, A WELWAAD LADISLAV ing. csc. , BANSKÁ BYSTRICA) KOŠALKO RUDOLF ing. csc.,BRATISLAVA, POTANCOKOVÁ MARTA, BANSKÁ BYSTRICA(54) Kmeň mikroorganlzmu Acramonium chrysogenumProdukčný kmeň mikroorganizmu Acremonium chrysogenum/Thirum et Sukap/ W. Gams CCM F-729 produkuje za aerobných podmienok kyselinu 7-/D~ 5-amino-5-karhoxy-n-valeramido/-3-acetoxymety 1-3-cefem-4-karboxylovú tzv. cefalosporín C vzorca ICefalosporín C sa používa na pripravu polosyntetickýcn cefalosporínových antibiotík.Cefalosporín C sa pripravuje submerznou fermentáciou v prítomnosti zdrojov síry. Väčšina priemyselných produkčných kmeňov sú auxotrofné mutanty dependentné na DL-metionín.V Kmeň Acremonium chrysoqenum CCM F-729 nie je závislý na DL-metioníne, produkuje cefalosporín C na ekonomicky výhodnýchzdrojoch síry, akým je Na 2 S 203.5 H 2 O.Vynález sa týka nového piemyselného mikroorganizmu produkujúceho kyselinu 7-/D-5-amino-5-karboxy-n-valeramido/-3-acetoxymetyl-3-cefem-4-karboxyiovú, obecného vzorca I, tzv. cefalosporín C /CFS-C/Cefalosporin C sa používa ako východzia surovina pri príprave polosyntetických cefalosporínovích antibiotík. Produkčný kmeň bol získaný v screeningovom programe, zameranom na izoláciu kmeňov nezávislých na DL-metioníne.Východzún kmeňom bola kultúra cephalosporium acremonium WIS OP 163, maximálna produkcia cefalosporínu C dosahovaná na pôdach s tiosiranom sodným ako zdrojom síry bola 200-400 g/ml. Cefalosporínové antibiotika odvodené od kyseliny 7-aminocefalosporánovej sú vyrábané prevážne pomocou kmeňa Cephalosporium acremonium /po reklasifikácii Gamsom W. v roku 1971 Acremonium chrysogenum/.Rod Cephalosporium je v systematike zaradený do čeľade Moniliceae do triedy Fungi imperfecti /Deuteromycetes/. U rodu Cephalosporium sú spôry vytvárané len terminálne na nevetvených konídioföroch, skoro pravidelne posadených na hlavnom mycéliu. Cephalosporium tvoí septované hýfy, septy delia protoplazmu na menšie úseky.Konídionosiče sú jednotlivé, silne bazofilné. Známa je reprodukcia nepohlavnou mitčzou a bunečnou elongáciou. Nepohlavné spöry sú jednobunečné konédie s jedným jadrom, vytvárané na hýfach.Bunky mycélia aj konídie obsahujú po jednom haploidnom jadre. Tieto vlastnosti si ponechávajü aj pri submerzných kultiváciách.Cephalosporium ako eukariotický organizmus má membránou ohraničené jadro s chromozomálnou štruktúrou a cytoplazmou 5 pomerne komplexmou membránovou štruktúrou /mitochondrie, endoplazmatické retikulum/. Významná je najmä mimohunečná akumulácia antibiotika spôsobená exkréciou cez koncentračný gradient.V suhnerznej kultúre sú prítomné štyri typy buniek septované hýfy, konídie, klíčiace konídie a artrospôry.Morfolôgia je rozdielna v závislosti od použitého zdroja síry. Pri fermentácii s použitím DL-metioninu je prevaha artrospôr, s existenciou ktorých je spojená maximálna tvorba antibiotika. Pri použití anorqanických zdrojov síry sú v submerznej kultúre V prevahe vlák~ nité formy hrúbka vlákna je menšia ako pri použití DL-metioninu.Popisovaný kmeň bol získaný nasledujúcim spôsobomPôvodný kmeň Caphalosporium acremonium WIS OP-163 bol spracovaný chemickým mutagénom N-nitrozometylbiuretom. Najlepší izolát pracovne označený 80 VULM produkoval V submerznej kultivacii 1 800 až 2 000 g/ml cefalosporínu C.Izolát Bc VULM bol v ďalšej fáze vystavený pôsobeníu ÚV žiarenia. získané izolátyboli hodnotené rýchlou screeningovou metódou na valčekoch z agarizovanej živnej pôdy5 rôznymi zdrojmi siry. Valčeky s vyrastenými kolönami na povrchu boli testované na agarovej platni.s testovacím mikroorganizmom Alcaligenes faecalis ATCC 8750, špecifickým pre cefalosporín C.Izolát 5 näjväčšim priemerom inhibičnej zóny na agarizovanej pôde s tiosíranom sodným bol ďalej testovamý V baniěkovej fermentácii a V laboratórnych fermentoroch. Izolát mal pracovné označenie 188 VULM, aktivita cefalosporinu C vo filtrátoch fermentačnej pôdy bola stanovenáv 168. kultivačnej hodine spektrofotometrickou metódou /Claridge C. A., Vaughan R. W.Antimicrob. Aqents Chemother., 1969, 131/ a metódou HPLC /vypracovaná VÚLM/. Genealogická schéma kmeňa je ozna ená ako schéma č. l. Izolát 188 VULM je uložený v Cs. sbírce mikroorganizmu UJEP v Brne pod číslom CCM F-729.Kmeň OP 163 WIS bol deponovaný vo forme lyofilyzovanej konzervy alebo krátkodobe na šikmom agare /sporulačná pôda označená NB-II zloženie uvedená V dalšm texte. Zo šikmého agaru bola pripravená vodná suspenzia o koncentrácii 105 až 106 konídií/ml. Sspenzia bola prefiltrovaná cez vrstvu vaty. Mutagén N-nitrozometylbiuret bol pridaný v koncentrácii 0,4 k suspenzii konidií.Mutangén bol v kontakte s kultúrou počas jednej hodiny na trepacom stroji /4 Hz/ pri teplote 27 OC. Po uplynutí expozície boli zo zmesi mutangén-kultúra pripravené riedenia IOŤZ až103 konidií/ml. Nariedenými suspenziami boli očkované Petriho misky s agarovou pôdou NB-II. Ako kontrola slúžila suspenzia spôr bez pridania mutangénu.operácie s mutangénom prebiehali bez pristupu denného svetla. Spoluprácia na Petriho miskách trvala pri teplote 27 °C 11 dni. Jednotlivé kolônie boli prenesené na šikmý agar NB-II a odskúšané na produkčnú aktivitu na baničkách.Z kultúry na šikmom agare bola pripravená suspenzia konidii zmytím povrchu 10 ml sterilnej vody. Suspenzia bola prefiltrovaná cez vatový filter zo základnej suspenzie boli pripravené pracovné riedenia 10 l 2 až 10-13 konŕdií/ml, ktorými boli naočkované Petriho misky/pôda NB-II/. zdrojom žiarenia bola germicidna UV-lampa /Philips TUV 30 W, vlnová dlžka253,7 nm sa podieľa na celkovej spektrálnej energií 93,5 /.Povrch agaru s nanesenými konúdiami bol exponovaný počas 1 minuty zo vzdialenosti 30 cm. Po ožiarení boli Petriho misky umiestnené v termostate, kde kultúra sporulovala 11 dní pri teplote 27 °C. Z vyrastených kolônií boli ihlovou technikou prenesené spôry na povrch agarových valčekov-bločkov.Po 5 dňoch bol povrch bločkov pokrytý kultúrou. Bločky boli umiestnené na sklenené platne s agarovou pôdou s obsahom 25 kultury Alcaliqenes faecalis ATCC 8750. Inkubácia bločkov trvala 18 hodín pri teplote 37 °C. Hodnotenie izolátov bolo založené na meraní inhibičných zón v okolí bločkov. Najlepší izolát bol z pôvodnej kolônie na Petriho miske vyočkovaný na šikmý agar NB-II a odskúšaný v laboratórnej aj štvrtprevádzkovej fermentácii.pH pôdy pred sterilizáciou -6,8.Používali sa 500 ml banky plnené 60 ml inokulačnej pôdy o žloženipH pred sterilizáciou sa upravuje na 7,0.Na očkovanie sa používa kultúra zo šikmého agaru alebo z jačmenných zrn, tzv. jačmenné konzervy. Príprava vegetatívneho inokula trvá 72 hodín pri teplote 27 °C na trepacom stroji/4 Hz/. Veqetatívnym inokulom sa očkujú produkčná pôdy rozplnené v 500 ml bankách po 40 mlNa očkovanie sa používa 8 obj./obj. vegetatívneho inokula. Kultivácia má podmienky totožné s prípravou vegetativneho inokula, dlžka kultivácie 168 hodín. Porovnanie produkčnej aktivity kmeňa Cephalosporium acremonium WIS OP-163 s izolátmi Bc VULM a 188 VULM je v tabuľke 1. Porovnané sú výsledky dosiahnuté v baničkovej fermentáciičíslo experimentu kmeň prod. aktivitaKmeň používaný vo fermentácii s použitím DL-metionínu ako zdroja síry.V laboratórnych sklenených tančíkoch /Výv. dielne CSAV/, objem 2 litre, pracovný objem 1 liter, bola pri podmienkach vzdušnenie 0,75 objemu vzduchu/objem pôdy, miešanie 10 Hz,teplota do 24 kultivačnej hodiny 28 °C, potom do konca fermentácie 23 °C, dosiahnutá produkčná aktivita 5 200 pq/ml za 168 hodín kultivácie.Morfolôgia kmeňa Morfolôgiu kmeňa Acremonium chysoqenum CCM F-729 je možné popísať nasledujúcim spôsobomPri monokolôniovom rozseve tvorí krémová v strede béžovo sfarbené kolónie o priemere S až 7 mm. Povrch kolónie je silne vrásčitý, okraje radiálne zbrázdené, stred kolónií je vyvýšený

MPK / Značky

MPK: C12P 35/06

Značky: mikroorganizmů, kmeň, chrysogenum, acremonium

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/5-245153-kmen-mikroorganizmu-acremonium-chrysogenum.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Kmeň mikroorganizmu Acremonium chrysogenum</a>

Podobne patenty