Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS IN – 04

Číslo patentu: 240846

Dátum: 01.01.1988

Autori: Zelina Pavol, Pavlík Anton, Adam Josef

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

ÚŘAD PRO VYNÁLEZYAutor vynàlezu KRIŠTOFOVÁ HANA Rum.(54) Myši lymfocytárni hybridom IMG OZAS IN - 04Řešení se týká myšího lymfocytárniho bybridomu produkujiciho protilátku proti prasečĺmu a lidskému insulinu, uloženého ve sbírce hybridomů Ústavu molekulárni genetiky ČSAV pod označením IN - 04. Samotna monoklonálni protilátka bybridomu IN - 04 je vhodná pro použití V enzymoimunologické a radioimunologické analýze a pro čištění insulinu afinitni chromatografii.240 846 Vynález se týká nového hybridomu, tj. hýbridního jednobuněčného organismu, sestrojeného fúzí buňky myší myelomové linie P 3-X 63-Ag 8.653 a myší slezinné lymfoidní buňky, produkující protilátku proti prasečímu a lidskému insulinu.Doposud se protilátky proti insulinu vyrábějítak, že je insulin opakovaně injikován jako antigen pokusným zvířatům, nejčastěji morčatům. Sérum takto imunizovaných zvířat, odebírané po určité době působení antigenu, slouží jako zdroj protilátek, užívaných zejména pro kvantitativní stanovení plasmatického insulinu metodou radioimunologické analýzy. Tento postup,nazývaný konvenční imunizací, má několik nevýhod. V séru imunizovaných zvířat se nachází heterogenní směs protilátek, jejichž spektrum je v každém jednotlivém organismu různé a neopakovatelné. Organismus zpravidla vytvoří kromě protilátek vůči žádanému antigenu i protilátky proti nečistotám antigenního preparátu. Výrobní šarže konvenčních sér se proto dají těžko standardizovat a výcházejí z výroby v Širokém rozmezí kvality. Pro výrobu každé šarže je třeba připravit čistý imunizační antigen a další antigeny pro vysycení balastních protilátek proti nečistotám.Uvedené nedostatky výše zmíněného a dosud používaného postupu odpadnou, je-li k disposici hybridom, produkující monoklonální protilátku proti insulinu, uložený ve Sbírce hybridomü Ústavu molekulární genetiky ČSAV v Praze 4, Vídeňská 1083, pod označením IMG CZAS IN-O 4.Uvedený hybridom byl získén způsobem známým z odborné literatury (Fazekas de St. Groth, S., Scheidigger, D. Production of monoclonal antibodies Strategy and tactics,J.Immunol. leth.,35 l-21, 1980 Galfré, G., Howe, S.C., 3 24 u 846Milstein, C., Butcher, G.W., Howard, J.C. Antibodíes to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines, Nature 266550, 1977) klonováním souboru hybridních buněk, vzniklých fúzí buněk myší myelomové linie P 3 ~X 63-Ag 8.653 a buněk, získaných že slezíny myší kmene BALB/c, imunizoyaných prasečim insulinem.Výhodou hybridomu je, že produkuje homogenni protilátku, tzv. protilátku monoklonálni, která je schopna specificky reagovat s prasečím i lidským insulinem. Hybri-~ dom IN-04 je možné kultivovat in vitro v médiich vhodných pro živočíšne buňky a je adaptován pro růst in vivo v peritoneální dutině myši kmene BALB/c. Z konserv, uchovávaných v kapalném dusiku, je možné zahájit produkci protilátky bez dalšího antigenu. Protilátka, produkovaná hybridomem IN-O 4, reaguje jak s prasečim, tak lidským insulinem(tj. rozeznává determinantu spoĺéčnou pro tyto dva velmi podobné peptidy) a neni třeba se zbavovat protilátek balastnich.Za účelem pomnožení hybridomových buněk in vivo bylo aplikováno 5 x 106 buněk do peritöneáĺní dutiny myší. Aby došlo k lepšímu uchycení aplikovaných buněk, byla myš 14 dni před přenosem buněk hybridomu ovlivněna parafinovým olejem (0.5 ml intraperitoneálně). Po 20 dnech růstu hybridomu v peritoneálni dutině byla myš zabita a naprodukovaná ascitická tekutina odebrána Celkem bylo ziskáno 2.0 ml ascitické tekutiny, které obsahovala 7 mg/ml imunoglobulinu. Protilátka reagovala se specifickým antigenem (lidským nebo prasečím insulinem) V enzymoimunologickém testu(při použití prasečí antimyší protilátky značené křenouou peroxidázou) až do ředěni 12107. Po navázáni protilátky naagarosový gel bylo možno na tomto imunosorbentu izolovat insulin metodou afinitní chromatogrefie.4,. 240 846 Buňky hybridomu IN~ 04 maji ultrastrukturnf obraz typických myelombvých buněk. Buňky hybridomu obsahujíjádracharakteŕist 1 cké značnou-polymorfií. Cytoplasma Abuněk obsahuje velké množství polyribosomú, mitochondriea slabé vyvinuté endoplasmatické retikulum. In vitro rostou jako polosuspenzní kultury. základním kultivačnimédiem je Eaglovozminimálni esenciální médium s Hanksovou solnou směsi doplnené o neesenciální aminokyseliny, L~glutamin (3 mM), pyruvát sodný (1 mM). Totoámédium (označované jako H-MEMd, Ústav molekulární genetiky ČSAV) je pyo kultivaci hybridomu IN-o 4 doplněnopenicilinem,streptomycinem, gentamycinem, 2-merkaptoetanolem (0.05 mM) pufrem HEPES (10 mM) a inaktivovaą ným bovinním sérem (Bioveta, Ivanovice na Hané, 10). Hybridom je kultívován při 37 °C. Střední generačni čas je 21.5 hod. a 10 měsíců po segtrojeni-byl modálni počet chromosomů 89. Produkovanáeprotilátka je monoklonálni imunoglobulin podtřidy IgG 1 s lehkými řetězci typu ,její isoelektrický bod je v rozmezi pH 7.0 - 7.2.1Hybridom IN-04 může být průmyslové využíván jako zdroj monoklonálni protilátky proti insulinu v metodách analytických nebo preparativních.. Monoklonální protilátka hybridomu IN-O 4 může být využite pro analytické stanovení ínsulinu při klinické diagnostice v zdravotnických zařízeních, zvláště endokrinologicky zaměřených. Imobilizované Éhoklonální protilátky může být použito k čištění insulinu pomocí afinitni chromatografie.

MPK / Značky

MPK: C12N 15/00

Značky: hybridom, lymfocytární, myší

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/5-240846-mysi-lymfocytarni-hybridom-img-czas-in-04.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Myší lymfocytární hybridom IMG CZAS IN &#8211; 04</a>

Podobne patenty