Rekombinantne modifikovaný plazmín

Číslo patentu: E 8081

Dátum: 21.04.2005

Autori: Hunt Jennifer Audrey, Novokhatny Valery

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Ľudský plazminogén je jednoreťazcový proteín s obsahom 791 aminokyselinových zvyškov. Aktivácia plazminogénu na plazmín je výsledkom jednoduchého štiepenia Arg 561-Va 1562 peptidovej väzby v zymogéne. Výsledná molekula plazmínu je dvojreťazcová, disulfidicky viazaná serínová proteáza špecifická pre pôsobenie trypsinu0002 Aminozakončenie ťažkého reťazca plazmínu (zvyšky 1561, 60 kDa) obsahuje päť kľučkových domén, každá s obsahom približne 80 aminokyselinových zvyškov. Kľučkové domény sú zodpovedné za regulačná vlastnosti plaminogénu,ako interakcia s inhibitormi aktivácie, napr. Cl iónmi so stimulátçrmi aktivácie, napr. kyselinou 3-aminokaprónovou s cicavčími a bakteriálnymi bunkami a s inými proteínmi, ako fyziologickým substrátom plazmínu - fibrinom a s inhibítorom plazmínu az-antiplazmínom. Zo všetkých piatich kľučiek, kľučka 1 je najviac multifunkčná ukázalo sa, že jej aktivita viazať lyzín je zodpovedná za interakciu plazmínu s a 2-antiplazminom a fibrínom. Pozri Wiman, B., a spol., Biochim. Biophys. Acta 579142-154 (1979) a Lucas,M.A., a spol., J. Biol. Chem. 258 4249-4256 (1983).0003 C-zakončenie ľahkého reťazca plazmínu (zvyšky 562 791, ~ 251 Da) je typická serinová proteáza, homológna s trypsínom a obsahuje klasickú serín proteázovú triádu His 603, Asp 646 and ser 741. Plazminogén obsahuje 24disulfidických mostíkov a 2 glykozylačné miesta na Asn 289and Thr 346. 0004 Ukázalo sa, že ohraničenou proteolýzou plazminogénuelastázou vznikajú tri fragmenty (Sottrup-Jensen, L., a spol., Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol., 3191-209 (1978. Prvý fragment, K 1-3 obsahuje prvé tri kľučky a môže byť izolovaný V dvoch formách, Tyr 79-Val 338 a Tyr 79-Val 354. Druhý fragment, K 4 zodpovedá štvrtej kľučke a obsahuje Va 1355-Ala 440. Posledný, C-terminálny fragment (nazývaný miniplazminogén) obsahuje zvyšky Va 1443-Asn 791 a obsahuje piatu kľučku a serín proteázovú doménu. Miniplazminogén môže byť aktivovaný rovnakým spôsobom ako plazminogén, za vzniku mini-plazmínu.0005 Komplexná štruktúra celej molekuly plazminogénu neumožňuje jeho expresiu V baktériách a preto baktérie nie sú vhodné pre produkciu rekombinantného plazminogénu. Plazminogén je produkovaný vo forme nerozpustnýchinklúznych teliesok a nie je možné ho zložiť V tejto forme. Ďalej, expresia plazminogénu V cicavčích bunkách je komplikovaná intracelulárnou aktiváciou plazminogénu na plazmin z výslednou cytotoxicitou. Tvorba plne aktívneho plazminogénu v hmyze je možná, avšak pre nízky výťažok tento systém nie je vhodný pre tvorbu veľkého množstva. 0006 Preto je želateľný modífikovaný rekombinantný proteín, ktorý má požadované vlastnosti plazmínu/plazminogénu v zmysle chýbania niektorých negatívnych vlastností, a ktorý v bakteríálnych bunkách je tvorený V dostatočnom množstve.0007 Predkladaný vynález poskytuje polynukleotid obsahujúci nukleotidovú sekvenciu kódujúcu polypeptid definovaný V nároku 1 alebo 2.0008 V niektorých uskutočneniach, kódovaný polypeptid je najmenej 90 , 95 , alebo 98 identický so sekvenciou označenou V SEQ ID NO 2. Ďalej, kódovaný polypeptid môže mať sekvenciu zaznamenanú v SEQ ID NO 2.0009 Nukleotidová sekvencia polynukleotidu môže byť sekvencia označená v SEQ ID NO 1 alebo jej degenerované variácie.0010 Iný aspekt vynálezu poskytuje polypeptidy kódované polynukleotidom tak, ako je definované vyššie.0011 V niektorých uskutočneniach môžu polypeptidy vykazovať fybrinolytickú aktivitu, ktorá je inhibovaná azantiplazmínom rýchlosťou, ktorá je asi 5-násobne vyššia ako rýchlosť inhibície fibrinolytickej aktivity mini-plazminu az-antiplazmínom. Rýchlosť ínhibicie dg-antiplazmínom môže byť tiež najmenej 10-násobne, 20-násobne, 30-násobne alebo 40-násobne vyššia ako rýchlosť inhibícíe mini-plazmínu. 0012 V niektorých uskutočneniach môžu polypeptidy viazať imobilizovaný lyzín. Tento imobilizovaný lyzin môže byť lyzin naviazaný na pevnú podpornú matrix, vybranú zo skupiny obsahujúcej lyzin-agaróza, lyzin-BIOGEL (BioRad, Hercules, CA), lyzin-HYPERD (Pall Life Sciences, East Hills, NY, a lyzi-hydrogél), lyzin-SEPHAROSE (sefaróza naviazaná na agarózu). Imobilizovaný lyzín môže byť lyzínSEPHAROSE.0013 V niektorých uskutočneniach polypeptidy môžu mať nižšiu väzobnú afinitu pre fibrinogén ako väzobnú aktivitu pre fibrinogén mini-plazmín.0014 V niektorých uskutočneniach môžu mať polypeptidy vyššiu väzobnú afinitu pre čiastočne rozštiepený fibrín,ako je väzobná aktivita pre čiastočne nerozštiepený fibrín mini-plazmín.0015 V niektorých uskutočneniach polypeptidy môžu mať takú sekvenciu aminokyselín, ako znázorňuje SEQ ID NO 2 a jej konzervatívne substitúcie. Polypeptidy môžu mať zvyšok v relatívnej polohe analógnej k polohe 76 aminokyselinovej sekvencii zaznamenanej V SEQ ID NO 2, čo je arginín.0016 V inom (uskutočnení vynález obsahuje vektory pre polynukleotidy podľa vynálezu, a kultivované hostiteľské bunky, ktoré obsahujú tieto vektory.0017 Obrázok 1 je schematické znázornenie plazmínu po aktivácii proteolytickým štiepením. Kl-K 5 sú oblasti kľučiek a SP je doména serínovej proteázy. a 2-AP je d 2 ~ antiplazmín väzobné miesto na kľučke 1.Obrázok 2 je schematické znázornenie mutantu plazminogénovej delecie podľa vynálezu pri použití rovnakého názvoslovia ako na Obrázku 1, znázorňuje deléciu K 2-5.Obrázok 3 zaznamenáva sekvenciu ľudského plazminogénu,označuje vedúcu sekvenciu ako -19 až -1, a sekvenciu plazminogénu ako zvyšky 1-791 (pozri SEQ ID NO 3 (CDNA sekvencia pre ľudský plazminogén a SEQ ID NO 4, kódovanúsekvenciu aminokyselín, ako ukazuje Obr. 3). Je ukázaných veľa znakov, vrátane nasledovných sekvencia deltaplazminogénu (vyšrafované) domény kľučiek l-5 (dvojito podčiarknuté) glykozylačné miesta Asn 289 a Thr 346(zVýraznené) a lyzin vàzobné miesto v kľučke l (jevyšrafované a označené špecifickým očíslovaním miesta). Obrázok 4 zaznamenáva porovnanie polypeptidovej sekvencie piatich domén kľučiek (1-5) natívneho ľudského plazmínu (ogénu). Aminokyselinové zvyšky, ktoré sú identické s tými,V rovnakej relatívnej polohe V kľučke l, sú podčiarknuté. Obrázok 5 je záznam elektroforetického delenia delta plazminogénu na 8-25 SDS-PAGE neredukovaného (línia 1) a redukovaného (línia 2) prípravku. Aktivácia deltaplazminogénu na delta-plazmín streptokinázou (línia a 3),tkanivovým aktivátorom plaminogénu (tPA) (línia 4) a urokinázou (línia 5) vedie k tvorbe dvojreťazcovej molekuly s obsahom kľučky 1 (K 1) a serín proteázovej domény spojených dvomi disulfidickými mostíkmi.Obrázok 6 graficky znázorňuje aktiváciu delta-plazminogénu urokinázou. Urokináza (5,8 nM) bola pridaná do roztoku 5 M delta-plazminogénu v PES s obsahom 1,0 mM S-2251 pri teplote 37 °C. Zvýšenie absorbancie bolo merané pri 405 nm. Obrázok 7 je chromatogram, ktorý zaznamenáva vazbu deltaplazminogénu na lyzín-sefarózu 4 B 0,5 mg prečistenéhodelta-plazminogénu bolo nanesených na lyzín-sefarózu 4 B kolónu (lx 3 cm), ekvilibrovanú Tris pufrovaným soľným roztokom. Naviazaný proteín bol eluovaný z kolóny O-20 mM gradientom 8-aminokaprónovej kyseliny (8-ACA) ako jeden pík. Absorbancia pri 280 rm 1 a koncentrácia 3-ACA ako funkcia objemu eluentu je zaznamenaná na grafe.Obrázok 8 zaznamenáva väzbu delta-plazminogénu na fibrín. Rôzne koncentrácie delta-plazminogénu boli inkubované so zrazeninou fibrínu na mikrotitračnej platničke 1 hodinu pri teplote 37 °C. Po inkubácii bola zrazenina intenzívne premytá PBS a potom bol do každej jamky pridaný roztok 0,1 mg/ml tPA. Po dvojhodinovej inkubácii pri teplote 37 °C bol odstránený roztok a k zostávajúcej pevnej zrazenine bolo pridaných 100 l 1 M NaOH. Množstvo fibrínu bolo kvantifikované meraním absorbancie pri 280 nm. Stupeň fibrinolýzy, ktorý je výsledkom väzby delta-plazminogénu na fibrín, bolo zaznamenané na grafe ako funkcia koncentrácie delta-plazminogénu (plná čiara). Prerušovaná čiara znamená najlepšie hodnotenie experimentálnych dát podľa väzobnej rovnice.Obrázok 9 znázorňuje elektroforetické delenie počiatočného delta-plazminogénu na 8-25 SDS-PAGE v neredukujúcichObrázok 10 ukazuje schematicke diagramy plazmínu, miniplazmínu, mikro-plazmínu a delta-plazmínu spolu s príslušnou charakterizáciou enzymatickej aktivity (kat a KM vzhľadom k substrátu S-2251 (D-Val-Leu-Lysp-nitroanilid,DiaPharma Group, Inc., West Chester, OH.Obrázok 11 graficky znázorňuje delta-plazmínom indukovanú lýzu zrazenin celej krvi. Ku každej zrazenine (0,8 x 7 cm) bol pridaný 1 ml roztoku (okyslený soľný roztok, pH 3,6) s obsahom plazmínu (1,0 mg/ml), alebo delta-plazmínu (0,44 mg/ml), a rozpúšťanie zrazenin trvalo 1 hodinu pri teplote 37 °C.0018 S cieľom poskytnúť jednoduchú, neglykozylovanú molekulu s vlastnosťami fibrínu a antiplazmín vâzobnými vlastnosťami plazmínu plnej dĺžky, predkladaný vynález poskytuje skrátený mutant plazminogénu. Tento mutant je tu označovaný ako delta-plazminogén, kde aspoň časť nativnej sekvencie aminokyselín je V doméne homológnej s kľučkou 1 a aktivačné miesto je odstránené. V jednom uskutočnení domena homológna s natívnou kľučkou 1 domény ľudského plazminogénu môže byť priamo pripojená k serín proteázovej časti

MPK / Značky

MPK: C12N 9/68

Značky: plazmín, rekombinantné, modifikovaný

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/48-e8081-rekombinantne-modifikovany-plazmin.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Rekombinantne modifikovaný plazmín</a>

Podobne patenty