Aktivácia ACE2 na liečbu ochorení srdca, pľúc, ľadvín a hypertenzie

Číslo patentu: E 5038

Dátum: 19.06.2003

Autori: Crackower Michael, Penninger Joseph

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Tento vynález sa týka zloženia a spôsobu použitia v díagnostike a v liečení ochorení srdca, pľúc a ľadvín a okrem iného aj hypertenzíe, koronárnych ochorení srdca, zlyhania srdca a ľadvín, pľúcneho edému a pľúcnych stavov napr. pri toxickom šoku alebo umelej ventilácii.rizikovým faktorom ochorenia srdca je vysoký krvný tlak. Hypertenzia je kvantitatívny stav s mnohými faktonni, na ktorom sa podieľajú genetické aj environmentálne faktory. Aj keď o environmentálnych faktoroch, ktoré môžu prispievať k vysokému krvnému tlaku (jedálnyniekoľkých predpokladaných lokusov kvantitatívnych znakov (QTL), spojovanýchs hypertenziou v rámci modelov na zvieratách, nebol žiadny z týchto lokusov prevedený na gény. Molekuláme a genetické mechanizmy, ktoré spôsobujú vysoký tlak a ďalšie kardiovaskuláme ochorenia, teda zostávajú do značnej miery neznáme.angiotezín I (Angl). Činnosť enzýmu, ktorý premieňa angíotezín (ACE) katalyzuje štiepenie AngI na aktívny oktomér angiotenzín II (AnglI), ktorý môže prispievať k hypertenzii tak, že podporuje vazokonstrikciu hladkého vaskulámeho svalstva a reabsorpciu sodíka v nefrónoch. U myší s mutáciami ACE sa objavovala spontánna hypotenzia, čiastočná samčia neplodnosť a malfomiácia ľadvín. U ľudí sa polymorñzmus ACE spája s detenninantmi ľadvinových a srdcových funkcií a farmakologická inhibícia receptorov ACE a AngII je účinný prostriedok na znižovanie krvného tlaku a ochorenia ľadvín. Inhibícia receptorov ACB a Angll má pozitívne účinky aj v prípadoch srdcového zlyhania.0004 V nedávnej dobe bol určený homológ ACE nazvaný ACE 2. K jeho expresii dochádza prevažne V bunkách cíevneho endotelu ľadvín a srdca. Je zaujímavé, že dva homológy ACE existujú aj u múch. Na rozdiel od ACE ñinguje ACE 2 ako karboxypeptidáza, ktorá štiepi jediný zvyšok AngI a takto vytvára Angl-9 a jediný zvyšok z ANgII a vytvára Angl -7. Tieto biochemické údaje z výskumu in vitro naznačovalí, že ACE 2 moduluje RAS a môže teda hrat nejakú úlohu v regulácii krvného tlaku. Úloha ACE 2 v kardiovaskulámom systéme a RAS in vivo nie je známa.0005 Oonoghue a kol. (Circulation Research 87 č. 5 el-e 9, 2000) popisuje určenie ACE 2 z knižnice cDNA.0006 Yagil a kol. (Hypertension 33 č. l 261-265, 1999) vykonal genetické vyšetrenie chromozomálnych lokusov spojovaných s vysokým tlakom potkanov.0007 Acton a kol. v americkom patente US 6,194,556 (W 0 02/ 12471) popisuje využitie ACD 2 pri diagnostike a terapii stavov, ktoré súvisia s ACE 2. Patent konštatuje, že hladina expresie ACE 2 sa pri vysokom tlaku zvyšuje a antagonistí či inhibítory činnosti ACE 2 by boli užitoční pri liečbe zvýšeného krvného tlaku alebo súvisiacich porúch. Kanadská patentová prihláška č. 2,372,387 uvádza konkrétne príklady inhibítorov ACE 2, ktoré by mali byt užitočné pri liečbe chorôb srdca ako je vysoký tlak. Znovu zdôrazňuje potrebu inhibovať, nievšak zvyšovať aktivitu ACE 2. Tieto referencie, ktoré vyjadrujú potrebu inhibovat aktivitu ACE 2 sú založené len na údajoch z experimentov in vitro. Neuvádzajú údaje z pokusov in vivo ako napríklad údaje o cicavcoch s vyradenou funkciou, ktorá by charakterizovala ACE 2. Doposiaľ neboli žiadne inhibítory ACE 2 schválené ako farmaceutické prípravky na liečenie vysokého tlaku. Úloha ACE 2 v kardiovaskulámom systéme a RAS in vivo je navyše stález väčšej častí neznáma. Vyžaduje sa popísať funkciu ACE 2, aby bolo možne navrhnúť vhodné diagnostické testy a farmaceutické prípravky na liečenie ochorení srdca a ľadvín.0008 Vynález poskytuje novú paradígmu regulácie systému renín-angiotezín a znázorňuje úplne nové a neočakávané využitie ACE 2 v protiklade k predpovediam, založeným na údajoch z výskumu in vitro (patent Acton) a k predchádzajúcemu stavu ako kritický negatívny regulátor RAS, ktorý je nevyhnutný pre funkciu srdca a kontrolu krvného tlaku. Aktivácia ACE 2 je kriticky dôležitá pre liečenie i prevenciu ochorenia srdca, pľúc a ľadvín. Vynález prvýkrát ukazuje, že podávanie aktivátora ACE 2 živočíchom zabraňuje hypertenzii,ochoreniam srdca a ľadvín a zraneniam pľúc a lieči ich. Rozsah tohto vynálezu je definovaný v nárokoch.STRUČNÝ POPIS VÝKRESOV 0009 Príklady použitia vynálezu budú uvedené vo vzťahu k výkresom, kdeObr. 1. Sekvencia a chromozómová mapa potkanieho ACE 2.a. Poradie bielkovín ACE 2 potkanov, myší a ľudí s použitím myšacieho a ľudského testikulárneho ACE (T-ACE). Tieňovanie čiernou farbou označuje zhodu aminokyselín. Tieňovanie šedou farbou označuje stupeň podobnosti aminokyselín. b,schematická doménová štruktúra ACE a ACE 2. Všimnite si, že ACE 2 obsahuje iba jednu doménu ACE s konsenzuálnym miestom viazania zinku HEMGH. Katalytické centrá sú označené čiernou farbou, signálny peptid je označený šedo a transmembránová doména prerušovanou čiarou. c, vzory expresie myšacích a potkaních génov ACE 2 V rôznych tkanivách dospelých jedincov a V rôznych dňoch embryonálneho vývoja (E 7 7. embryonálny deň). Všinmite si, že u ACE 2 myší, nie však ľudí či potkanov (nie je znázomené) sú prítomné dve izoformy, čo je podobné javu pozorovanému pri ACE 15. Výsledky radiačného mapovania potkanieho ACE 2 v porovnaní s mapou QTL, identiñkovanou u živočíchov so závislosťou na príjme soli podľa Sabry (SS-X), potkanov SHRSP (BP 3) a SHR (BB.X). Názvy polymorfných markérov sú uvedené vľavo od ideogramu. J e vyznačené skóre LOD a hodnoty thetapre markéry súvisiace s ACE 2. cR centiRady.Obr. 2. Hladiny expresie ACE 2 V modeloch hypertenzie potkanov.a, Analýza metódou Northern blot pre ACE 2 mRNA z ľadvín potkanov SBH/y a SBN/y. Horná časť zobrazuje zastúpenie blotov s hladinami kontroly aktínu. Spodná časť zobrazuje relatívne hladiny prenosu ace normalizované k hladinám aktínu. b, Analýza hladín bielkovín ACE z ľadvín potkanov Sabra SBH/y a kontrolných potkanov SBN/y, ako aj potkanov SHR a SHRSP a kontrolných potkanov WKY metódou Western blot. Je uvedený systolický krvný tlak (BP) v mmHG pre príslušných potkanov Sabra. Spodný panel zobrazuje relatívne hladiny bielkovín ACE 2 s korekciou na aktín. Priamky zobrazujú hodnoty mediánu /- SEM. pObr. 3. Cielené prerušenie myšacieho ACE 2 pomocou homológií rekombinácie.a, stratégie Gene targeting. Je zobrazená časť dívokého typu lokusu myšacieho ace 2 (hore). Čierne štvorčeky označujú exóny. Cielený vektor bol navrhnutý tak, aby nahradil exón 9,kódujúci katalytickú doménu, ktorá viaže zinok génom rezistencie k neomycínu (neo , ktorý je umiestnený V opačnom smere. Na negatívnu selekciu sa využila kináza tymidinu (TK). Bočné sondy 3 a 5 , použité pre metódu Southem analysis, sú označené čiarkovaným obdlžnikom. b, Analýza ES buniek acew a aceJy metódou Southem blot. Genomickà DNA bola natrávená EcoR.I a hybridízovaná na bočných sondách 3 a 5 znázomených na obr. a. c,Analýza expresie bielkovín ACE 2 v ľadvinách myší aceHy a aceJy metódou Western blot. Anti-ACE 2 Ab reaguje s oblasťou N-terminálu pri výmaze. d, Analýza expresie mRNA ACE v srdci a v ľadvinách myší acem a acěly metódou RT-PCR. Na kontrolu sú znázornená rôzne cykly PCR pre lineárne zosílňovanie a hladiny GAPDH mRNA.Obr. 4. Normálny krvný tlak a funkcia ľadvína, meranie krvného tlaku 3 mesačných myší acelly (n 8) a acey (n 8) v neprítomnosti(vľavo) či prítomnosti blokátora ACE kaptoprilu. Krvný tlak bol určený s využitím meracích zariadení na chvoste. Uvádza sa stredná hodnota /- SD. Kaptopril sa podával myšiam 2 týždne pred meraním krvného tlaku tak, ako je to uvedené v Postupoch. Tieto hodnoty krvného tlaku sa potvrdili použitím invazívneho hemodynamického merania a Landendorfovho merania (nie je uvedené). Rozdiely u myší acelly a aceéy , ktorým sa podával kaptopril sa výrazne odlišujú od sledkov príslušných skupín bez terapie ( p 0,01). b, V prípade šesťmesačných myší acey a aceJy sa zistila normálna histológia ľadvín. Šípky označujú glomeruly.a, Rezy srdca izolované zo šesťmesačných myší acelly a ace farbené HE. U myší ace° sa zistilo zväčšenie ľavej komory (LV) a pravej komory RV). Celková veľkosť srdca však bola u oboch genotypov porovnateľná a makroskopicky ani v izolovaných kardiomyocytoch sa nezistil žiadny dôkaz hypertrofie srdca. b, Kvantitatívna analýza pomeru hmotnosti srdcak hmotnosti tela u šesťmesačných myši acew (n 8) a acěly (n 8) ako ukazovateľa hypertroñe srdca. Je potrebné konštatovať, že hmotnosť tela, hmotnosť srdca, dĺžka holennej kosti, pomer hmotnosti srdca k dĺžke holennej kosti zostávali v rôznych genetických skupinách nemenne v každom skúmanom veku (nie je zobrazené). c, d, U myší a aceJy nebola prítomná intersticiálna fibróza. Jedným z hlavných rysov dilatovanej kardiomyopatie je intersticiálna ñbróza. Avšak v srdciach myší acely (n 8) a acěb (n 8) bola intersticiálna ñbróza porovnateľná. Obr. c zobrazuje zafarbenie PSR jednotlivých sŕdc. Všimnite si normálnu perivaskulárnu fibrózu, označenú červeno v divokom type aj pre mutantov. D,kvantitativna analýza fibrotických zmien intestícia.Obr. 6. Výsledky straty ACE 2 pri ťažkom kontraktilnom zlyhaní srdcaa, echokardiograñcké merania kontrahujúcich sŕdc šesťmesačných myší aceHy a dvoch acey. Špičky a údolia označujú systoly a diastoly jednotlivých úderov. Šípky označujú vzdialenosť medzi systolickými sťahmi (LVESD) a diastolickým uvoľnením (LVEDD), teda hodnoty,ktoré určujú percento frakcionálneho skrátenia (FS). Všimnite si zväčšenie rozmerov systoly a diastoly myší aceHy , ktoré naznačuje dilatáciu srdca. Experimentálne údaje sú uvedené v tabuľke 1. b, percentuálne frakcionálne skrátenie a rýchlosť skracovania obvodových vlákien, dva hlavne parametre srdcovej kontrakcie pozorované u šesťmesačných acełly (n 8) a aaa (n 8) myši a šesťmesačných myších sarničiek acell (n 5) a ace (n 5). Hodnoty sa zistili pomocou echokardiograñe. Sú uvedené stredne hodnoty /- SD. p 0,05, p 0,01 medzi genetickýrni skupinami. Experimentálne údaje sú zaznamenanéV tabuľke l. c, Meranie krvného tlaku u šesťmesačných samčekov myší aceHy (n 8) a aceJy(n 8) a šesťmesačných myšich samičiek ace (n 5) a ace (n 5). Sú uvedené stredné hodnoty /- SD. Hodnoty krvného tlaku boli potvrdené pomocou invazívneho hemodynamického merania znázorneného v tabuľke 2. p 0,05.Obr. 7. Regulácia markérov hypoxie zvýšenia hladiny angiotenzínu II v neprítomnosti ACE 2 a,b, Analýza hladín expresie BNIP 3 a PAI-l mRNA, dvoch génov indukovaných pomocou hypoxie u šesťmesačných samčekov myší aceľly (n 5) a aceJy (n 5) metódou Northern blot. Obr. a znázorňuje jednotlivé údaje z analýzy Northem blot a obr. b uvádza relatívne hladiny BNIP 3 a PAI-l mRNA norrnalizované ku kontrolnej hladine gapdh. p 0,01c, Hladiny peptidov angiotenzínu I (Angl) a angiotenzínu II (AngII) v srdci a v ľadvinách šesťmesačných samčekov myší acc (n 8) a aceJy (n 8) z jedného vrhu. Hladiny AngI a AngII v tkanive sa určili pomocou rádioimunologických skúšok. Uvádzajú sa stredné hladiny peptidov /- SD. p 0,0 l.Obr. 8. U dvakrát mutovaných myší ACE-ACEZ nedochádza k zlyhaniu srdcaa, Meranie krvného tlaku u šesťmesačných samčekov myší aceHy (n 8) a acc (n 8) a dvakrát mutovaných myši aceľ ace 2 (n 6). Uvádzajú sa stredné hladiny /- SD. Hodnoty krvného tlaku sa potvrdili pomocou invazívneho hemodynamického merania. p 0,0 l u mutantov V porovnaní s divokým typom myší. b, Percento frakcionálneho skrátenia a rýchlosť skracovania obvodových vlákien u šesťmesačných samčekov myší acely (n 8) a aceľy (n 8), ace 1(n 8) a dvakrát mutovaných aceJ ace 2 y (n 6) myší zjedného vrhu. Hodnoty bolí stanovené pomocou echokardiograñe. Uvádzajú sa stredné hladiny /- SD. p 0,01 medzi genetickými skupinami. Výsledky experimentov sú zaznamenané v tabuľke 3. c,Echokardiograñcké meranie kontrahujúceho srdca u šesťmesačných samčekov myší aceĺł aceJy ,ace a dvakrát mutovaných aceľ aceľły myší z jedného vrhu. Echokardiograrny boli analyzované a sú označené podľa popisu na obr. 6 a. Všimnite si, že ablácia ACE na pozadí ace 2 nula úplne potlačuj e kontraktilné srdcové defekty, pozorované u raz mutovaných myšíObr. 9. Percentuálna zmena elastancie od základnej hodnoty bola vypočítaná v čase. Elastancia pľúc bola vypočítaná vydelením tracheálneho tlaku objemom.Obr. 10. a, Ľudská ACE 2 DNA (SEQ ID č. l). b, Ľudský polypeptid ACE 2 (SEQ ID č. 2). Obr. ll. a, Myšacia ACE 2 DNA (SEQ ID č. 3). b, Myšací polypeptid ACE 2 (SEQ ID č.4). Obr. 12. Polymorñzmy a sekvencie nukleotidov ACE 2.0010 Vynález predstavuje novú paradigmu regulácie systému RAS a ukazuje, že ACE 2 je kriticky dôležitým negatívnym regulátorom RAS, ktorý sa Vyžaduje pre srdcové a kardiovaskulárnc funkcie, fungovanie ľadvín a zranenie pľúc. Vynález prvýkrát vysvetľuje využitie terapeuticky účinného množstva polypeptidu ACE 2 alebo nukleovej kyseliny ACEZ na prípravu liečiva ohľadne liečenia stavu so znížením ACEZ zvoleného z hypertenzie, zo zlyhania srdca, chronickej nedostatočností srdca, akútneho zlyhania srdca, infarktu myokardu,aterosklerózy, zlyhania ľadvín alebo ochorenia pľúc cicavcov, kde sa ochorením pľúc rozumie chronické ínštruktívne pľúcne ochorenie, zápal pľúc, astma, chronická bronchitída,

MPK / Značky

MPK: A61K 48/00, C12N 9/64, A61K 38/43

Značky: ľadvín, aktivácia, hypertenzie, srdca, pľúc, ochorení, liečbu

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/47-e5038-aktivacia-ace2-na-liecbu-ochoreni-srdca-pluc-ladvin-a-hypertenzie.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Aktivácia ACE2 na liečbu ochorení srdca, pľúc, ľadvín a hypertenzie</a>

Podobne patenty