Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Opis 0001 Tento vynález sa týka oblasti výroby rekombinantných proteínov.0002 Angiotenzín konvertujúci enzým (ACE 2) predstavuje kľúčový enzým renin-angiotenzínového systému. Ako karboxypeptidáza je ukotvený na membránu ako receptor predovšetkým na bunkách pľúc, obličiek a srdca, ale aj exprimovaný na endotelových bunkách a štiepi rôzne peptidové substráty. Prominentní zástupcovia substrátov sú angiotenzín ll (Ang ll), ktorý sa štiepi na angiotenzín 1-7 (Ang 1-7), angiotenzín I, ktorý sa štiepi na angiotenzín 1-9, ale taktiež apelín a bradykinín. Ang Il a Ang 1-7 sú antagonisty renin-angiotenzínového systému. ACE 2 je riadením pomeru peptínov smerodajný na reguláciu hrúbky ciev, ako aj zodpovedný za permeabilitu endotelu a pritom ovplyvňuje homeostázu organizmu. Expresia ACE 2 je mimo iného riadená cytokínmi a znižuje sa v rôznych zápalových ochoreniach, čo v ďalšom následku vedie k patologickému obohateniu Ang II, jedného z najdôležitejších substrátov ACE 2.0003 ACE 2 slúži na liečbu syndrómu akútnej dychovej tiesne (ARDS) alebo akútneho poškodenia pľúc (ALI), dvoch foriem ochorenia pľúc, s ktorými je prevádzaná znížená expresia ACE 2 v pľúcach. Pre túto terapiu sa používa rekombinantný rozpustný humánny ACE 2, ktorý je daný systemicky a v najkratšom čase je k dispozícii v celom organizme, aby sa odbúrala zvýšená koncentrácia Ang |I a pritom sa vytvoril Ang 1-7. Toto kompenzuje negatívne účinky zvýšených koncentrácii Ang II. Preto je žiaduce mať v rukách produkt, ktorý má vhodný farmakologický profil podľa toho sa vhodná látka vyznačuje dobrou distribúciou v organizme s farmakologicky zmysluplným polčasom rozpadu, ako aj nízkou imunogenicitou. Zvlášť musí byť produkt enzymaticky aktívny, dobre rozpustný, ako aj byt stabilný v roztoku a reprodukovateľný vo vysokej čistote a dať sa ekonomicky spodobniť.0004 Tipnis a kol. (J Biol Chem. 275 (43) (2000) 33238-43) opisujú izoláciu ACE 2 (to označeného ešte ako ACEH) a izoláciu jeho cDNA. Produkciou v bunkách vaječníkov čínskeho škrečka (CHO) sa ziskal glykozylovaný proteínový monomér s mólovou hmotnosťou 120 kDa. Po deglykozylácii mal tento proteín hmotnosť 85 kDa.0005 Donoghue (Circ Res. 87 (5) (2000) 1-9) opisuje expresiu rozpustného ACE 2 v CHO bunkách,ktorý nebol úplne glykozylovalovaný a vyznačoval sa mólovou hmotnosťou približne 90 kDa. Tento dokument sa týka ďalšieho porovnávania rôznych sekvencii ACE 2 a anti-ACE 2 protilátok.0006 W 0 2004/023 270 A 2 sa týka kryštalizácie ACE 2 po expresii ACE 2 monomérov v hmyzích bunkách Sf 9. Mólová hmotnosť proteínu sa pritom určila na 89,6 kDa pomocou hmotnostnej spektrometrickej analýzy.0007 Vincent a kol. (Wrology Journal 2 (69)2005 doi 10.1186/1743-422 X-2-69) sa týka farmaceutickej účinnej Iátky chlorochin, ktorá v terminálnej glykozylácii napadá ACE 2. Zmenenou glykozyláciou je viazaný ACE 2 žiadnym resp. zlým receptorom pre SARS-CoV.0008 Warner a kol. (J. Biol. Chem. 280 (47) 2005 39353-39362) opisujú rekombinantnú expresiu ACE 2 a ACE v CHO bunkách a v MDCKIl bunkách. V CHO bunkách exprimovaný ACE 2 sa Westernblotovaním detegoval ako samostatný, približne 120 kDa polypeptid v rozpustených membránových prípravkoch. V MDCKlI bunkách exprimovaný ACE 2, ktorýje opísaný ako kompletne glykozylovaný,sa vo Western blottingu opísal ako jednotlivé, približne 120 kDa pásy proteínu, ktoré deglykozyláciou prešli na približne 92 kDa.0009 Manfred Schuster. Peptide and protein-based therapeutics (Peptidové a proteínové terapeutiká) (Mining The Plasma Proteome, Hotel Del Coronado (2008) 1-11) je zošit abstraktovCambridge Healthtech Institute ku konferencii, na ktorej sa predstavila produkcia ACE 2 v CHO bunkách.0010 Kosta kol. (J. Mol. Recognit. 13 (2000)360-369) uvádzajú vyšetrenia dimerizácie ACE.0011 Prabakaran a kol. (Biochem. Biophys. Res. Com. 314, (2004) 235-241) opisujú 3 D štruktúru ACE 2 a jej relevantnosť ako receptora pre SARS-CoV.-2 0012 Vickers a kol. (J. Biol. Chem. 277 (2002)14838-14843) opisujú vlastnosti ACE 2, ktoré sa vytvorili v hmyzích Sf 9 bunkách.0013 lmai a kol. (Nature 436 (2005) 112-116) sa týka liečby ARDS pomocou ACE 2.0014 Tipnis a kol. (J. Biol. Chem. 275 (2000) 33238-33243) a Guy a kol. (Biochimica et Biophysica Acta 1751 (2005) 2-8) sa týkajú štúdií rozdielov medzi ACE 2 (označeného aj ako ACEH) a ACE.0015 Terapeutícké presadenie účinnej enzýmovej substitučnej terapie si vyžaduje výrobný proces,ktorý ekonomicky a reprodukovateľne spodobňuje vysoko čistý, farmakologicky účinný produkt. Rozpustný extracelulárny úsek ACE 2 obsahuje 7 N-glykozylačných miest. Neglykozylovaný ACE 2 je zle rozpustný, má sklon k agregovaniu, je zvýšene imunogénny a má skrátený polčas rozpadu. Okrem toho má menší hydrodynamický priemer, ktorý negatívne ovplyvňuje predovšetkým čistenie. Preto je cieľom tohto vynálezu poskytnúť vysoko aktívny ACE 2 s dobrým in vivo polčasom rozpadu. Tento cieľ sa splnil pomocou predmetov nárokov.0016 Tento vynález sa týka rekombinantného glykozylovaného rozpustného ľudského, dimérového, enzymaticky aktívneho ACE 2 polypeptidu. ACE 2 polypeptid podľa vynálezu je glykozylovaný,pričom výhodne má glykoskupiny monoméru ACE 2 polypeptidu v sume najmenej 10, 11, 12, 13, 14,15 alebo najmenej 16 radikálov kyseliny sialovej, výhodne najmenej 14 radikálov kyseliny sialovej, a pričom ACE 2 polypeptid existuje ako dimér. Rovnako je tu opísané ACE 2 monomér s tu uvedenými glykozyláciami, mólovými hmotnosťami a ďalšími špecifikáciami. Dimérje výhodne homodimér, jeho monomérnejednotky majú predovšetkým totožnú sekvenciu a glykozyláciu. Spravidla sú monomérne jednotky diméru spojené nekovalentne. Monomér možno získat z diméru bez ďalšieho denaturačnými krokmi. Všetky tu uvedené výhodné glykozylácie sa týkajú ako diméru tak monoméru, vrátane jedného alebo oboch monomérov dimérového komplexu. Zvlášť výhodne dimér obsahuje dva ióny zinku.0017 Pod radikálom kyseliny sialovej sa rozumejú hlavne radikály typu kyseliny N-acetylneuramínovej (Neu 5 Ac) predovšetkým na N- alebo O-glykozyláciách.0018 V zásade je stabilita terapeutickej látky veľmi dôležitým kritériom pre jeho polčas rozpadu a tým jeho účinnosť.0019 Rekombinantný humánny ACE 2 sa dosiaľ identitikoval výlučne ako monomér a ako taký je tiež opísaný v literatúre vzhľadom na svoju funkčnosť, svoju kryštalickú štruktúru, ako aj vzhľadom na svoju interakciu s vysoko špecifickým inhibítorom.0020 Takto napríklad Towler a kol. (J Biol Chem 279(17), 2004 17996-18007) s odkazom na Vickers a kol. (J Biol Chem 277(17), 2002 14838-14843) opisujú expresiu ACE 2 v hmyzích Sf 9 bunkách, ktorý sa po šetrnej gélovej permeačnej chromatografii, ako posledného kroku čistenia získal ako monomér. Mólová hmotnosť monoméru činila 89,6 kDa.0021 Komerčne dodávaný ACE 2 rovnako existuje ako monomérna forma (od spoločnosti RD Systems, katalógové číslo 933-ZN, číslo šarže FIU 035071), ktorá sa vyrába podľa metódy uvedenej v Tipnis a kol. (2000, vyššie) s rozdielom, že ako expresný systém sa používajú bunky NSO namiesto CHO. Opísané sú monoméry, ktoré jednak v redukovaných tak neredukovaných podmienkach majú mólovú hmotnosť 120 kDa.0022 Podľa Donoghue a kol. (Circ Res 87, 2000 e 1-e 9) sa exprimovali ACE 2 monoméry v CHO bunkách, ktoré po sekrétovaní vykazovali molekulovú hmotnosť 90 kDa.0023 Všetky tu uvedené dokumenty a publikácie sú tu zahrnuté odkazom.0024 Na stabilizovanie terapeutickej látky podľa vynálezu sa vyvinul spôsob, ktorý vedie výlučne k stabilným ACE 2 dimérom, ktoré majú ako výrobno-technické tak aj fannakologické výhody v porovnaní s ACE 2 monomérmi.0025 Dimerizácia prináša nasledujúce výhody-3 o Lepšia rozpustnosť a biologická dostupnosť vo fyziologických roztokoch dimér vykazuje vysokú rozpustnosť a dlhší in vivo polčas rozpadu a dostupnosť.o Žiadna tvorba agregátov ACE 2 dimér vytvára stabilné komplexy bez usadzovania dalších ACE 2 molekúl na dimér.o Redukované napadanie proteázy potom čo sú jednotlivé úseky proteínu a pritom so všetkou pravdepodobnosťou za C-terminálnou časťou nasmerované do vnútra diméru, tento C-koniec sa neodbúrava.o Stúpajúci polčas rozpadu Kvôli zníženej imunogénnosti, lepšej rozpustnosti a redukovanej náchylnosti na proteolytické odbúravanie sa zvyšuje polčas rozpadu proteínu.o Jednoduché čistenie proteínu hydrodynamický priemer ACE 2 diméru je kvôli svoje štruktúre a zvýraznenej solvatačnej obálke väčší ako vypočítaný. Preto sa dajú ATE 2 diméry gélovými permeačnými kolónami vynikajúco oddeliť od klasických kontaminantov z expresie proteínu, ako napríklad sérového albumínu (67 kDa).0026 Výhodne je rekombinantný ACE 2 polypeptid glykozylovaný na najmenej 80 možných Nglykozylačných pozícií a má podiel cukrov väčší ako 10 (hmotnostných percent celkového ACE 2),alebo 11 , 12 , 13 , 14 , výhodne väčší ako 15 alebo 16 , 17 , 18 , 19 , predovšetkým väčší ako 20 , alebo 21 , 22 , 23 24 alebo 25 .0027 Vyvinul sa výrobný proces, ktorý reprodukovatelne spodobňuje vysoko čistý a enzymaticky aktívny, silne komplexne glykozylovaný ACE 2. Produkt sa vyznačuje svojim vysokým podielom cukrov ( 20 hmotnostných) a komplexnými, silne rozvetvenými, čiastočne záporne nabitými štruktúrami cukru. Tieto pôsobia pozitivne na rozpustnosť, biologickú dostupnosť, enzymatickú aktivitu, ako aj fannakologické vlastnosti produktu. Volbou vhodného expresného konštruktu vhodného expresného hostitela, optimálnej stratégie výberu, média prispôsobeného metabolizmu buniek,ako aj puntičkársky vykonanej analýzy a selekcie klonov, sa môžu vyprodukovať bunkové línie, ktoré sekrétujú požadovaný produkt.0028 ACE 2 sa exprimoval už V hmyzích Sf 9 bunkách a v myších NSO bunkách. Materiál sa použil predovšetkým v in vitro pokusoch. Taktiež sú výsledky prechodnej expresie ACE 2 v CHO bunkách. Až dosiaľ sa nevyprodukovali bunkové línie s procesne vhodnou produktivitou. Ďalej sa ešte nevykonala primeraná selekcia klonov vzhľadom na vlastnosti produktu, predovšetkým vzhľadom na Nglykozylácíu.0029 Rozpustnosť proteínu sa určila nielen jeho aminokyselinovou sekvenciou, ale aj jeho skladaním, ako aj pomocou post-translačných modifikácii. Sú to predovšetkým nabité štruktúry cukrov, ktoré rozhodujúco zvyšujú rozpustnosť proteínu a ovplyvňujú jeho farmakologický profil. Takto možno pre Európsky patentový úrad (EPO) zaznamenať, že prítomnost komplexných rozvetvených glykoštruktúr pozitívne ovplyvňuje polčas rozpadu tohto proteínu.0030 Principiálne do úvahy pre rekombinantnú expresiu ACE 2 pripadajú rôzne expresné systémy,pričom prokaryotické hostitelské bunky sa kvôli chýbajúcemu spracovania N-glykozylačných miest dalej nebudú testovať.0031 Výhodne má najmenej 70 glykozylovaných N-glykozylačných pozícií štruktúru zvolenú zo vzorcov 1 až 8 nezávisle od seba(Vzorec 5) (Vzorec 6) (Vzorec 7) (Vzorec 8) Pričom je GlcNAc Fuc Q Man O Xyl Gal O Neu 5 Ac0032 Výhodne sú všetky možné N-glykozylačné pozície glykozylované.0033 Výhodne má najmenej 80 , výhodne najmenej 90 , predovšetkým 100 glykozylovaných N-glykozylačných pozícii štruktúru podľa vzorcov 1 až 8.0034 Výhodne má ACE 2 monomérová jednotka diméru molekulovú hmotnosť najmenej 90 kDa,výhodne najmenej 92 kDa, zvlášť výhodne najmenej 94 kDa, zvlášť najmenej 96 kDa, zvlášť výhodne najmenej 98 kDa, najvýhodnejšie najmenej 100 kDa, 100,5 kDa, 101 kDa, 101,5 kDa alebo aj najmenej 102 kDa. Absolútna mólová hmotnosť -taktiež samotného peptidu bez hydrátovej obálky - sa môže určiť peptidovou mapou. Vyššie glykozylované formy môžu mat aj mólové hmotnosti najmenej 103 kDa, 104 kDa, 105 kDa, 106 kDa, 107 kDa alebo najmenej 108 kDa.0035 Určenie mólových hmotnosti, ktoré ovplyvňujú ďalšie faktory ako hydrátové obálky - ako napríklad Chromatografia alebo gélová elektroforéza vo vodných systémoch - môžu viesť aj k vyšším výsledkom. V dalších uskutočneniach má ACE 2 monomérová jednotka diméru zdanlivú molekulovú hmotnosť najmenej 101 kDa alebo najmenej 102 kDa, výhodne najmenej 105 kDa, zvlášť výhodne najmenej 109 kDa, predovšetkým najmenej 113 kDa, zvlášť výhodne najmenej 177 kDa, najvýhodnejšie najmenej 119 kDa, akoje určené gélovou elektroforézou.0036 V ďalších uskutočneniach je molekulová hmotnosť monoméru (zdanlivá alebo absolútna) maximálne 102 kDa, 103 kDa, 104 kDa, 108 kDa, 110 kDa, 112 kDa, 116 kDa, 120 kDa, 125 kDa,

MPK / Značky

MPK: A61K 38/48, C12N 9/64

Značky: polypeptid

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/43-e19673-polypeptid-ace2.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Polypeptid ACE2</a>

Podobne patenty