Detekcia a modulácia SLIT a ROBO sprostredkovanej angiogenézy a ich použitia

Číslo patentu: E 15124

Dátum: 10.03.2003

Autor: Geng Jian-guo

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Detekcia a modulácia SLIT a ROBO sprostredkovanie angiogenézy a ich použitia0001 Angiogenéza je bunečný proces kapílár-neho pučania a konfigurácie neurovaskulatúr z existujúcich krvných ciev. To je v protiklade k inému procesu tvorby krvných ciev,nazývanému vaskulogenéza, ktorým sa krvné cievy de novo vytvoria koalescenciou endoteliálnych progenitorových buniek. Vpriebehu vývoja primáta, ako je embryogenéza a tkanivová/orgánová morfogenéza, sa krvné cievy vytvárajú ako vaskulogenézou, tak angiogenézou. Avšak u dospelých sa nové cievy vytvárajú iba prostredníctvom angiogenézy. Okrem ženských reproduktívnych cyklov (ovulácia, menštruácia, nidácia a tehotenstvo) sú endoteliálne bunky nečínné a teda majú u normálneho dospelého cicavca dlhý polčas rozpadu. Avšak po vhodných stimuloch podstupujú aktivačný proces, aby vyrástli do nových kapílárV priebehu epizodického rastu a remodelácie krvnej cievnej siete.0002 Angiogenéza je zásadne dôležitá vrade fyziologických a patologických stavov a ochorení, vrátane ischémie a hypoxie, aterosklerózy, transmigrácie a rekruitrnentu leukocytov,hemostázy, hojenía rán, syndrómu presakovania cievnej steny, diabetickej retinopatie,makulárnej degenerácie, neovaskulámeho glaukómu, psoriázy, reumatoidnej artritídy,hemangíómu a rakovinového rastu a metastáz (Hanahan, D. and Folkman, J. Cell 862353-364(l 996) Carmeliet, P. and Jain, R. K. Nature 4072249-257 (2000. V súčasnosti je dobre rozpoznaná dôležitosť angiogenézy pre rast radu rakovín. Napríklad rast pevných nádorov vyžaduje sprevádzajúce rozšírenie cievnych sietí pre ich zásobovanie krvou vie sa, že nedostatočné zásobovanie kwi (viac než 100 až 200 m od krvných ciev) vedie knekróze rakovinových tkanív. Aj keď sú vaskulárny endotelíálny rastový faktor (VEGF), ñbroblastový rastový faktor (F GF), angiopoitíny a ďalšie molekuly nevyhnutné pre tvorbu ciev (Hanahan, D. Science 277148-50 (l 997) Yancopoulos, G. D. et al. Nature 4072242-248 (2000, stále sú niecelkom pochopené molekulové a bunečné mechanizmy, ktoré riadia nádorovú angiogenézu.0003 U stavovcov je cievny systém hlavne pre transport materiálu, zatiaľ čo nervový systém je hlavne pre predávame informácií je pozoruhodné, že oba majú anatomicky aj fyziologickyNapňklad (l) kapiláme cievy sa vytvárajú endoteliálnymi bunkami opuzdrenými pericytmi,zatiaľ čo nervy sú tvorené neurónmi obklopenými gliami (2) ako krvné cievy, tak nervy sa vetvia takmer vo všetkých častiach tela a (3) obehový systém je rozdelený tepnami (posíelajúcimi krv od srdca) a žilami (posíelajúcimi krv späť do srdca), zatiaľ čo nervový systém má ako motorické nervy (posielajúce impulz z mozgu alebo miechy), tak senzorické nervy (posíelajúce impulz späť do mozgu alebo miechy). Okrem zdieľania týchto morfologických a funkčných znakov majúkrvné cievy a nervy úzko fyzický vzťah, napríklad autonómne nervy, ktoré regulujú cievny tonus.0004 V súčasnosti sa vie, že hľadanie nervových sietí vyžaduje niekoľko rodín neurologických migračných sígnálov, ako je semaforín, efrín, netrín, Slit a niekoľko ďalších. Význačný medzi týmito molekulami, ktoré súčasne podporujú angiogenézu, je neuropilín-l , membránový receptor zo semaforínovej rodiny, exprimovaný ako na vyvíjajúcich sa neurónoch, tak na endoteliálnych bunkách. Viaže sa na VEGF 165, zostrihovú izoformu VEGF génu (Soker, S. et al. Cell 9273545 (1998, a funkčne myšie embryá s jeho mutáciou vykazujú niekoľko defektov pri vytváraní ciev (Kawasaki, T. et al. Development 12614895-902 (1999. Neuropilín-l môžu exprimovat tiež nádorové bunky, čo má za následok v podstate zvýšenú nádorovú angiogenézu a zväčšené nádory. Analogicky na bunky naviazané efrínové ligandy a im blízke Eph receptorové tyrozín kinázy hrajú podstatné úlohy pri vývoji ciev. Z nich Eñin-BZ, transmembránový ligand špecificky exprimovaný na arteriálnych endoteliálnych bunkách a okolitých bunkách, interaguje s mnohými receptormi EphB triedy. Naopak EphB 4, špecifický receptor pre eňín-B 2, sa exprimuje na žilových endoteliálnych bunkách. Má sa za to, že obojsmerné signály medzi EphB 4 a efrínom-B 2 sú špecifické pre vývoj tepien a žíl (Wang, H. U. et al. Cell 9374-53 (1998. Ďalej je EphA 2 receptor up-regulovaný v transformovaných bunkách a nádorových vaskulatúrach, kde pravdepodobne prispievajú k rakovinovej patogenéze (Brantley, D. M. et al. Oncogene 2117011-26 (2002. Taktiež sa vpriebehu včasnej tvorby krvných ciev pozoroval potkaní netrinl receptor Unc 5 h 2 mRNA, čo implikuje potenciálnu účasť netrínu a jeho receptorov pri vaskulogenéze (Engelkamp, D. Mech. Dev. 1181191-197 (2002.0005 Gordon et al. (Phase I Safety and Pharmacokinetic Study of Reeombínant Human AntiVascular Endothelial Growth Factor in Patients With Advanced Cancer, Joumal of Clinical Oncology, Vol. 19 843-850 (2001 uvádza podávanie rekombinantnej ľudskej monoklonálnej protilátky zameranej proti vaskulárnemu endotelíálnemu rastovému faktoru (VEGF) pacientoms určitými typmi rakoviny za účelom štúdie farmakologickej prijateľnosti protilátky. PodľaGordona et al. nie je podávanie protilátky vytvorenej autormi spojené s klinicky význanmýmis infúziou súvisiacimi vedľajšimi účinkami bežnými pri iných protilátkach.0006 Slit 2, člen ďalšej rodiny neurologických migračných signálov, sa exprimuje centrálnymi bunkami a endoteliálnymi bunkami. Reaguje s bunečným povrchovým transmembránovým proteínom, Roundaboutl (Robol) a funguje ako repelent pri navádzaní axónov (Kidd, T. et al. Cell 922201-215 (l 998) Brose, K. et al. Cell 962795-806 (l 999) Li, H. S. et al. Cell 962807-818 (1999 a vetvení (Wang, K.-H. et al. Cell 961771-784 (l 999) Whítford,K. L. et al. Neuron 3347-61 (2002, neuronálnej migrácii (Wu, W. et al. Nature 4002331-336(1999 a ako endogénny inhibitor pre chemotaxiu leukocytov (Wu, J. Y. et al. Nature 410948952 (2001. V súčasnosti existujú tri slit gény, Slítl, 2 a 3 a štyri robo gény, robol, robo 2, rig-1 a robo 4, známe u cicavcov. Zistili sa ich expresie mimo nervový systém u hlodavcov (Holmes,G. P. et al. Mech. Dev. 7957-72 (l 998) Piper, M. et al. Mech. Dev. 94 213-217 (2000. Napríklad mRNA pre Slit 2 a Slít 3, ale nie pre Slítl, sa nachádzajú v potkaních endoteliálnych bunkách a Robol RNA sa nachádza v myších leukocytoch (Wu, J. Y. et al. Nature 410948-952(2001. Ďalej ľudské endoteliálne bunky exprimujú Robo 4 (Huminiecki, L. et al. Genomics. 79547-552 (2002. Avšak nie je zistené, čí tieto gény môžu exprimovať ľudské rakovinovébunky, obzvlášť na úrovni proteínov.0007 Predkladaný vynález je zameraný na farmaceutické kompozícíe a použitie zlúčenín naprípravu liečiv na inhibíciu Slit 2 sprostredkovanej nádorovej angiogenézy u subjektu.0008 V jednom aspekte je predkladaný vynález zameraný na použitie zlúčenín na prípravu liečiv na inhibíciu Slit 2 sprostredkovanej nádorovej angiogenézy u subjektu, ako sa definujenárokom 1. Uskutočnenia tohto použitia sa deñnujú nárokmi 2-10. 0009 V ďalšom aspekte je predkladaný vynález zameraný na farmaceutické kompozícíe nainhibíciu Slit 2 sprostredkovanej s nádorom spojenej angiogenézy u subjektu, ako sa deñnujenárokom 11. Uskutočnenia týchto kompozícii sú deñnované nárokmi 12 a 13.Stručný opis obrázkov na yýkresoch0010 Obrázok l ukazuje expresie Slit 2 V A 375 bunkách a Robol V endotelíálnych bunkách. a a e, Slit 2 mRNA V A 375 bunkách a Robol mRNA V HUVEC sa stanovili semikvantitatívnou RT-PCR analýzou. Šípky označujú pozitívne-Slit 2 a Robol pásy. Ľudská B-aktínová mRNA sa testovala ako kontroly pre RT-PCR. P-C (PCR kontrola) bola PCR V neprítomnosti templátov RT-C (RT kontrola) bola PCR s použitím templátu vytvoreného bez reverznej transkriptázy. b a f, Northem blot Slit 2 (~ 5,0 kb) V A 375 bunkách a Robol (~ 4,6 kb) v HUVEC. GSPDH(housekeeping (prevádzkový) gén) sa použil ako kontrola. c a g, Proteínové expresie Slit 2 v A 37 5 bunkách (~ 210 kDa) a Robol (~ 210 kDa) V HUVEC sa detegovali pomocou anti-Slit 2 a Robol Abs, ale nie pomocou preimunitného IgG. Slit 2/293 bunky a Robo 1/293 bunky sa použili ako pozitívna kontrola, zatial čo V/293 bunky sa použili ako negatívna kontrola. d, Afinitne puriñkovaný Slit 2 bol zafarbený striebrom alebo imunoblotovaný pomocou anti-myc mAb,9 El 0. h a i, imunohístochemické sfarbenie pevných nádorov pomocou anti-Slit 2 Ab (šípka označuje expresiu Slit 2 na A 375 bunkách), anti-Robol Ab (hrot šípky označuje expresiu Robol na endotelíálnych bunkách V nádore) a preimunitným IgG. Meradlo 100 m pre h a 20 m pre i. Výsledky predstavovali dva až desať jednotlivých pokusov.0011 Obrázok 2 ukazuje Slit 2-vyvolané migrácie a tvorby kapilár. Migrácie HUVEC (a a b),Robol/293 buniek a 293 buniek (c) sa merali s použitím testu s Boydenovou komorou. Výsledky sa vypočítalí ako priemer i S.D. hodnoty pre trojité uskutočnenie merania z troch až šiestich jednotlivých pokusov. Na meranie smerových mi grácií HUVEC sa aplíkoval proteínový gradient z mikropipety pulzačnou aplikáciou 0,15 M Slit 2 alebo 1 M bFGF. Mikrografy fázového kontrastu jednotlivých endotelíálnych buniek sa zaznamenali v označených časových bodoch po expozícii gradientom Slit 2 alebo bFGF. Hrot šípky označoval smery, V ktorých sa proteíny napĺňali cez pipety. Meradlo 8 m. Znázomili sa migračné smery vyvolané pomocou Slit 2 abFGF (e) a prejdené vzdialenosti (l) (každá bodka znázorňuje migračný smer a vzdialenosťjedinej endoteliálnej bunky). g, Tvorby kapilár HUVEC na Matrigelu sa vizualizovali fázovoukontrastnou mikroskopiou. Meradlo 60 m. h a i, Účinky Slit 2 a bF GF na tvorbu kapilár HUVEC bez alebo s RoboN alebo R 5. Výsledky sa vypočítalí ako priemer d S.D. hodnoty z trojitého uskutočnenia z troch až dvadsiatich jednotlivých pokusov. , p 0,05 a , p 0,0 l, V porovnaní s PBS kontrolou.0012 Obrázok 3 ukazuje inhibíciu nádorovej angiogenézy a rastu malígneho melanómu a,Detekcie RoboN, Slit 2 a tubulínu V A 375 bunkách po transfekcii pomocou RoboN Vloženého Vektora (RoboN/A 375), ale nie natívneho Vektora (V/A 375), pre nich špecitickými Abs. Žiadne

MPK / Značky

MPK: C07K 16/28, C07K 16/18

Značky: použitia, angiogenézy, sprostredkovanej, modulácia, detekcia

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/43-e15124-detekcia-a-modulacia-slit-a-robo-sprostredkovanej-angiogenezy-a-ich-pouzitia.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Detekcia a modulácia SLIT a ROBO sprostredkovanej angiogenézy a ich použitia</a>

Podobne patenty