Spôsoby expanzie buniek a použitia takto vyrobených buniek a kondiciovaných médií na liečbu

Číslo patentu: E 18850

Dátum: 22.03.2007

Autori: Aberman Zami, Burger Ora, Meretzki Shai

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

SPÓSOBY EXPANZIE BUNIEK A POUŽITIA TAKTO VYROBENÝCH BUNIEK A KONDICIOVANÝCH MÉDIÍ NA LIEČBU0001 Predložený vynález sa týka terapeutických použití adherentných buniek z plaoenty alebo tukových tkanlv kultivovaných v trojrozmerných kultivaćných podmienkach, napríklad na transplantáciu hematopoetických kmeňových buniek.0002 Vo vyvíjajúcej sa oblasti medicíny rastie potreba dospelých kmeňových buniek vo veľkých množstvách na použitie pri naštepovanl buniek av tkanivovom inžinierstve. Okrem toho sa neustále rozvíja terapia pomocou dospelých kmeňových buniek na lieöenie rôznych stavov, ako sú hematopoetické poruchy, srdcové choroby, Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba, mŕtvica, popáleniny, svalová dystrotia, autoimunitné ochorenia, diabetes a artritída.0003 Hematopoetické kmeňové bunky (HSC) sú prekurzorové bunky, z ktorých vznikajú všetky typy krvných buniek myeloidnej aj Iymfoidnej línie. Naštepovanie a inlciovanie krvotvorby prostredníctvom transplantovaných HSC závisl od schopnosti týchto buniek zacielovat sa a proliferovat v kostnej dreni príjemcu.0004 Všeobecne sa predpokladá, že kmeňové bunky sú tesne spojené in vivo s nespojitými medzerami v kostnej dreni poskytujúce molekulárnej signály, ktoré spoločne sprostredkúvajú ich diferenciáciu a samoobnovu, prostrednictvom kontaktov bunka-bunka kontakty alebo interakcií na krátke vzdialenosti. Tieto medzery sú súčasťou hematopoetického indukčneho mikroprostredia (HIM), zloženého z dreňových buniek,t.j. makrofágov, ñbroblastov, adipocytov a endotelových buniek. Dreňové bunky zachovávajú funkčnú integritu HIM tým, že poskytujú proteíny extracelulámej matrix (ECM) azložky bazálnej membrány, ktoré uľahčujú kontakt bunka-bunka. Poskytujú tiež rôzne rozpustné alebo rezidentné cytoklny potrebné na riadenú diferenciáciu a proliferáciu hematopoetických buniek.0005 interakcie medzi HSC a strómou sú potrebné na zachovanie životaschopnosti HSC a zabránenie ich diferenciácii. Po transplantácii HKB musia transplantované HSC zacielit do mikroprostredia kostnej drene (BM) a usadiť sa v príslušných medzerách, než začnú proliferovat a diferencovat sa. Počas procesu zacieľovania transplantované HSC opúšťajú krvný obeh a transmigrujú po gradiente chemokínov cez endoteliálnu bunkovú bariéru BM, až dosiahnu špecializované medzery. Darcovské HSC sa potom musia zacielit do hematopoetických medzier, kde nachádzajú priaznivejšie mikroprostredie na delenie HSC, a kde sa môže vytvorit kontinuum fyzikálnych a chemických kontaktov medzi HSC a mezenchymálnymi bunkami, ECM a vylućovanými rastovými faktonni. Všetky tieto procesy zahŕňajú komplexný súbor molekúl, ako sú cytoklny,chemokíny, honnóny, steroidy, proteíny extracelulárnej matrix, rastové faktory, proteíny interakcil bunkabunka, adhézne proteíny a proteíny matrix.0006 Celkový počet buniek naštepených všpecializovaných BM medzerách tvorí základ úspechu transplantácie HSC. Aby sa dosiahlo naštepenie, darcovské HSC transplantované do krvného obehu, by sa mali zacielit do drene príjemcu, kde sa vytvárajú funkčné hematopoetické ložiská. Počet týchto ložísk je uzavretý ako výsledok celkového počtu transfundovaných HSC vynásobený efektivitou ich naštepovania. 0007 Jedným z hlavných problémov pri transplantácii HSC je nízka miera prežitia týchto buniek v akceptorovom systéme. Je dobre zdokumentované, že transplantované intravenózne HSC sú odstránené z obehu a vizualizovane v BM priebehu niekoľkých minút po ich transfúzii. Tri až päť hodín po transplantácii HSCnie sú v periférne krvi prijemcov zistené žiadne darcovské bunky Askenasy et al 2002 Transplanted hematopoietic cells seed in clusters in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 202301-101. Drvivá väčšina transplantovaných buniekje zničená krátko po transfúzii. V dosledku toho má kolonizácia drene príjemcu nízku účinnost a 2-3 dni po transplantácii je v BM príjemcu detegovaných len 1-5 transfundovaných buniek Kerre et al 2001 Both CD 3438 and CD 3438- cells home specitically to the bone marrow of NOD/LtSZ scid/scid mice but show different kinetics in expansion. J Immunol. 16713692-8 Jetmore et al 2002 2002 Homing efficiency, cell cycle kinetics, and survival of quiescent and cycling human CD 34() cells transplanted into conditioned NOD/SCID recipients. Blood. 9921585-931.0008 Mezenchymálne stromálne bunky (MSC) sú heterogénnou populáciou buniek, ktoré sú schopné diferenciácie do rôznych typov mezenchymálnych zrelých buniek. Diferenciácia týchto buniek na retikulárne endotelové bunky, ñbroblasty, adipocyty a osteogénne prekurzorovové bunky závisí od vplyvov rôznych biologicky aktívnych faktorov.0009 Použitie MSC na podporu transplantácie HSC je v odbore známe. Niekoľko publikácií preukázala vyššiu efektivitu naštepenia HSC pri súčasnom transplantovani s mezenchymálnymi kmeňovými bunkami Gurevitch et al 1999 Trans Transplantation of allogeneic or xenogeneic bone marrow within the donor stromal microenvironment. Transplantation. 681362-8 Fan et al 2001 Successful allogeneic bone marrow transplantation (BMT) by injection of bone marrow cells via portal vein stromal cells as BMT-facilitating cells. Stem Cells. 19144-50. Bolo tiež preukázané, že súčasná transplantácia ľudských mezenchymálnych kmeňových buniek v modeli naštepovania človek-ovca malo za následok zvýšenie dlhodobého uchytenia štepu ľudských HSC chimérických BM u zvierat Almeida-Porada et al 2000 Co-transplantation of human stromal cell progenitors into preimmune fetal Sheep results in early appearance of human donor cells in the circulation and boosts cell Ievels in bone marrow at later time points after transplantation Blood. 953620-7. Zlstilo sa, že súčasné injektovanie HSC a mezenchymálnych kmeňových buniek zrýchlilo krvotvorbu Zhang et al 2004. Stem Cells 221256-62. V poslednej dobe sa tieto zistenia rozšírilo na príbuznejši zvieraci model - na opicu makak rézus. Keď sa spoločne transplantovali haploidentické HSC a mezenchymálne kmeňové bunky, bolo preukázané lepšie uchytenie štepu HSC Liu et al 2005 Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 262385-81. Nedávno bolo uvedené aj použitie mezenchymálnych kmeňových buniek na zlepšenie uchytenia štepu HSC u človeka Koc ON, J Clin Oncol. 200018307-316 Lazarus HM, Biol Blood Marrow Transplant. 2005 May 1 1(5)38998.0010 Prispenie MSC k uchyteniu hematopoetického štepu zjavne spociva v produkcii cytokinov podporujúcich HSC, ktoré podporujú sprostredkovanie a vyváženie zacieľovania, samoobnovu a potenciál špecializovania transplantovaných HSC pri prestavbe poškodeného hematopoetického mikroprostredia potrebného na zacielenie a proliferáciu HSC, a v inhibícii T buniek pochádzajúcich od darcu, ktoré by mohli spôsobiť reakciu štepu voči hostiteľovi (GvHD), Charbord P., and Moore, K., Ann. N.Y. Acad. Sci. 1044 159167 (2005) US patenty č. 6,010,696 65553741. Napríklad v štúdii od Maitre Maitra B, et al., Bone Marrow Transplant. 33(6)597-604. (2004) sa zistilo, že ľudské mezenchymálne kmeňové bunky podporujú nepríbuzné darcovské hematopoetické kmeňové bunky a potláčajú aktiváciu T-buniek v myšaoom modeli NOD-SCID, čo ukazuje, že nepribuzné MSC pochádzajúce z ľudskej kostnej drene môžu zlepšiť výsledok alogénnej transplantácie.0011 Jednou z hlavných prekážok pri používaní MSC je problém s izolovanlm veľkých množstiev bežne sa vyskytujúcich populácii týchto buniek, čo je technicky náročné a nákladné, čiastočne kvôli obmedzenemu počtu buniek. Najlepším zdrojom MSC je kostná dreň, ale nevýhodami týchto spôsobov je výrazný diskomfort pri zlskavanl kostnej drene aspiráciou a riziká biopsie. Bežne rozšírený názor, že ľudské embryo a plodpredstavujú nezávislý život, robia z ľudského embrya problematický zdroj kmeňových buniek, čím sa k už existujúcim Iogistickým problémom pridávajú aj náboženské a etické aspekty.0012 Nedávno boli uskutočnené pokusy nájsť alternatívne zdroje na odber kmeňových buniek. Takýmito alternatlvnymi zdrojmi sú napríklad tukové tkanivo, vlasové folikuly, semenníky, ľudská čuchová sliznica,embryonálny žĺtkový vak, placenta, adolescentná koža a krv (napr. pupočníková krv a dokonca menštruačná krv). Avšak odber kmeňových buniek z alternatívnych zdrojov v príslušných množstvách na liečebné a výskumné účely je stále obmedzený a všeobecne prácny, zahŕňajúc napríklad odber buniek alebo tkanív od darcu alebo pacienta, kultiváciu a/alebo množenie buniek in vitro, disekciu, atď. Puissant et al. (British Journal of Haematology 129 (2005), str. 118-129) skúma imunosupresívne vlastnosti dospelých kmeňových buniek pochádzajúcich ztukového tkaniva v porovnaní s imunosupresivnymi vlastnosťami mezenchymálnych kmeňových buniek kostnej drene.0013 Placenta sa považuje za jeden z najdostupnejšlch zdrojov kmeňových buniek, ktorý nepredstavuje žiaden diskomfort ani etické obmedzenia. Zistilo sa, že MSC pochádzajúce z placenty majú podobné vlastnosti ako MSC pochádzajúce z BM. Sú priInavé k plastu, exprimujú CD 105, C 073 a CD 90 membránové markery a neexprimujú CD 45, CD 34, CD 14, CD 19 a HLA-DR povrchové molekuly. Avšak na rozdiel od MSC pochádzajúcich z BM, MSC pochádzajúce z placenty (PD)-MSC ošetrené interferónom-v vďmi minimálne upregulovali HLA-DR. Navyše bunky PD-MSC bunky vykazujú imunosupresívne vlastnosti, ktoré sú zlepšené v prítomnosti interferónu-v. (Chang CJ, Yen ML, Chen YC, Chien CC, Huang Hl, Bai CH, Yen BL. Placentaderived Multipotent Cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 2006 Nov 24(11)2466-77).0014 Okrem toho MSC markery PD-MSC vykazujú jedinečné ESC povrchové markery SSEA-4, TRA-1-61 a TRA-1-80, čo naznačuje, že to môžu byt veľmi primitívne bunky. (Yen BL, Huang HI, Chien CC, Jui HY, Ko BS, Yao M, Shun CT, Yen ML, Lee MC, Chen YC. Isolation of multipotent cells from human term placenta. Stem Cells. 200523(1)3-9). Okrem toho PD-MSC (pôvodom z plodu), ale nie MSC pochádzajúce z BM, sú pozitívne na intracelulárny ľudský Ieukocytárny antigén-G (HLA) - (Chang CJ, Yen ML, Chen YC. Chien CC,Huang HI, Bai CH, Yen BL. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-gamma. Stem Cells. 2006 Nov 24(11) 2466-77).0015 Štúdie ukázali, že expanzný potenciál PD-MSC bol významne vyšší ako expanzný potenciál u dospelých MSC pochádzajúcich z BM (Yen BL, Huang HI, Chien CC, Jui HY, Ko BS, Yao M, Shun CT, Yen ML, Lee MC, Chen YC. Isolation of Multipotent cells from Human Term Placenta. Stem Cells. 200523(1)3-9 M.J.S. de Groot-Swíngs, Frans H.J. Claas, Willem E. Fibbe and Humphrey H.H, Pieternella S. intAnker,SicooA. Scherjon, Carin KIeijburg-van der Keur, Godelieve. Placenta Isolation of Mesenchymal Stem Cells of Fetal or Maternal Origin from Human. Sem CeIIs,2004221338-1345.) Okrem toho môžu adherentné bunky pochádzajúce z placenty diferencovat na osteoblasty, adipocyty a chondroblasty. Zistilo sa tiež, že rovnako ako MSC pochádzajúce z BM, aj MSC pochádzajúce z placenty potláčajú proliferáciu Iymfocytov pupočníkovej krvi (UCB), čo naznačuje, že kombinovaná transplantácia HSC a (PD)-MSC pochádzajúcich z placenty môže zredukovať potenciálnu reakciu štepu voči hostiteľovi (GVHD) u príjemcov Li CD, et al., Cell Res. Jul 15(7)539-47 (2005) a môže zvýšiť podporu krvotvorby ZhangYi et al., Chinese Medical JoumaI 117(6) 882-887 (2004). Použitie placenty ako zdroja amniotických epitelových buniek sa uvádza napríklad v W 0 00173421, ale získanie týchto buniek je stále prácne a výťažok MSC je velmi nízky.0016 Ďalší spôsob, ako vyriešiť problém obmedzeného množstva MSC, je ex-vivo expanzia týchto buniek za použitia rôznych podmienok kultivácie napr. US patenty č. 6326198 6030836 6555374 6335195 63389421. Avšak nevýhodou týchto spôsobov zostáva časovo náročná, špeciñcká selekcia a izolačné postupy, ktoré sú potrebné, čím sa tieto spôsoby stávajú nákladné a náročné.0017 V niekolkých štúdiách sa zistilo, že trojrozmerná (3 D) kultivácia buniek je účinnejšie z hľadiska výtažku Ma T, et al., Biotechnology Progress. Biotechnol Prog 152715-24 (1999) Yubing Xie, Tissue Engineering 7(5) 585-598 (2001). Použitie 3 D kultivačných postupov, ktoré napodobňujú prirodzené prostredie MSC, je založené na naočkovanl týchto buniek do perfúzneho bioreaktora obsahujúceho polyaktlvne peny Wendt, D. et al., Biotechnol Bioeng 84 205-214, (2003), rúrkových pórovitých nosných štruktúr kyseliny poIy-L-mliečnej(PLLA) perfúzneho bioreaktora s radiálnym prúdením Kitagawa et al Biotechnology and Bioengineering 93(5) 947-954 (2006) a bioreaktora s piestovým tokom na rast a expanziu hematopoetických kmeňových buniek (US patent 6.911.201).0018 Trojrozmerný rámec, ktorý viaže stromálne bunky, bol navrhnutý v US pat. č. 6,022,743 a hubový kolagén bol navrhnutý ako 3 D matnca v práci Hosseínkhani, H et al., Tissue Engineering 11(9-10) 1476-1488(2005). Avšak v žiadnej z týchto štúdií nebolo nikdy navrhnuté použitie MSC kultivovaných v týchto podmienkach na podporu in vivo uchytenia štepu HSC po transplantácii HSC. Bola tiež nevyhnutná časovo náročná optimalizácia rôznych podmienok, napr. podmienok perfúzie, alebo rôznych izolačných technik pre špeciñcké typy buniek.0019 Použitie perfundovanej popôrodnej placenty ako 3 D reaktora na kultiváciu MSC bolo navrhnuté v US patente č. 7045148 a v US patentových prihláškach č. 20020123141 20030032179 a 2005011871. Avšak tento postup je obmedzený do 24 hodin po izolovanl placenty a zahŕňa perfúziu, a teda nie je možný hromadný rast buniek a jeho udržanie po dlhšie časové obdobie.0020 Existuje teda všeobecne uznávané potreba a bolo by velmi výhodné mat k dispozícii nové spôsoby expanzie buniek a použitia buniek a takto produkovaných kondiciovaných médií na liečbu bez vyššie uvedených obmedzení.0021 Podľa jedného aspektu sa tu poskytuje spôsob expanzie buniek, pričom tento spôsob zahŕňa kultiváciu adherentných buniek z placenty alebo tukového tkaniva v trojrozmerných kultivačných podmienkach, ktoré podporujú expanziu buniek.0022 Podľa ďalšieho aspektu sa poskytuje spôsob výroby kondiciovaného média, pričom tento spôsob ktorý zahŕňa kultiváciu adherentných buniek z placenty alebo tukového tkaniva v trojrozmerných kultivačných podmienkach, ktoré umožnia expanziu buniek a zbieranie kondiciovaného média expandovaných adherentných buniek, čím sa vytvorí kondiciované médium.0023 Podľa ešte ďalšieho aspektu sa poskytuje populácia buniek vytvorených vyššie uvedenými spôsobmi. 0024 Podľa ďalšieho aspektu predloženého vynálezu sa tu poskytuje izolovaná populácia buniek zahŕňajúca adherentné bunky z placenty alebo tukového tkaniva, pričom tieto adherentné bunky vylućujú vyššiu hladinu najmenej jedného faktora vybraného zo skupiny pozostávajúcej z SCF, IL-6 a FIt-3, ako je hladina vylučovaná adherentnými bunkami z placenty alebo tukového tkaniva pestovanými v 2 D kultúre.0025 Podľa ďalšieho aspektu sa poskytuje izolovaná populácia buniek zahŕňajúca adherentné bunky z placenty alebo tukového tkaniva, pričom tieto adherentné bunky exprimujú vyššiu hladinu najmenej jedného protelnu vybraného zo skupiny pozostávajúca z H 2 A histónovovej rodiny (H 2 AF), aldehyd dehydrogenázy X(ALDH X), faktora elongácie eukaryotickej translácie 2 (EEEF 2). retikulokalbína 3, EF-hand domény viazania vápnika (RCN 2) a kalponín 1 základnej hladkej svaloviny (CNN 1), ako je hladina vylučovaná adherentnými bunkami z placenty alebo tukového tkaniva pestovanými v 2 D kultúre.

MPK / Značky

MPK: A61K 35/12, C12N 5/0775, C12N 5/073

Značky: buniek, takto, expanzie, použitia, médií, liečbu, vyrobených, spôsoby, kondiciovaných

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/42-e18850-sposoby-expanzie-buniek-a-pouzitia-takto-vyrobenych-buniek-a-kondiciovanych-medii-na-liecbu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsoby expanzie buniek a použitia takto vyrobených buniek a kondiciovaných médií na liečbu</a>

Podobne patenty