Oligonukleotidy určené na detekciu miR-20a-5p

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

(22) Dátum podania prihlášky 8. 8. 2014 (13) Druh dokumentu Yl(32) Dátum podania prioritnej prihlášky (51) ĺľlľ C 1- (201501)(33) Krajina alebo regionálna organizácia priority CIZQ 1/00(43) Dátum zverejnenia prihlášky 7. 1. 2015 CIZN 15/00 Vestník UPV SR Č. 01/2015 COIN(45) Dátum oznámenia 0 zápise ÚRAD úžitkového vzoru 2. 6. 2015 PRIEMYSELNÉHO Vestník UPV SR č. 06/2015 VLASTNÍCTVA (47) Dátum zápisu a sprístupnenia SLOVENSKEJ REPUBLIKY úžitkového vzoru verejnosti 4. 5. 2015(62) Číslo pôvodnej prihlášky V prípade vylúčenej prihlášky(67) Číslo pôvodnej patentovej prihlášky v prípade odbočenia(86) Číslo podania medzinárodnej prihlášky podľa PCT(87) Číslo zverejnenia medzinárodnej prihlášky podľa PCT(96) Číslo podania európskej pátentovej prihlášky(73) Majiteľ KRD molecular technologies, s.r.o., Bratislava, SK Krivjanská Mária, Mgr., Galanta, SK Krivjanský Viktor, Mgr., Galanta, SK Jurkovičová Dana, RNDr., PhD., Bratislava, SK Kulcsár Ľudovít, Mgr., Bratislava, SK(54) Názov Oligonukleotidy určené na detekciu nniR-ma-SpSyntetické oligonukleotidy navrhnuté na kvalitatívne a/alebo kvantitatívne stanovenie výskytu miR-ZDa-Sp vo vzorkáchtkanív alebo telesných tekutín.Riešenie sa týka oligonukleotidov komplementárnych k maturovanej forme miR-20 a-5 p, ktorá je súčasťou polycistronického klastra miR-17 ~ 92 známeho tiež ako onkomir-1. Tento klaster je lokalizovaný na chromozóme l 3 q 3 l, V treťom intróne primárneho transkriptu Cl 3 orf 25. Genomická ampliñkácia a zvýšená expresia tohto klastra bola popísaná V procese onkogenézy pri rôznych malignitách Vrátane lymfómov (napr. DLBCL), akútnej lymfoidnej a myeloidnej leukérnie, chronickej myeloidnej leukémie a solídnych nádorov prsníka, vaječníkov, prostaty, žalúdka, hrubého čreva a iných. Klaster miR-17-92 pozostáva zo šiestich miRNA (miR-l 7, 18 a, 19 a, 20 a, 19 b-1 a 92 a-1), ktoré patria k najpotentnejším ľudským onkogénnym miRNA. miR-ZOa bola identifikovaná ako kľúčová molekula zodpovedná za onkogénnu aktivitu celého klastra rniR-17-92.Oligonukleotidy komplementárne k maturovanej forme mÍR-ZOa-Sp môžu slúžiť ako nástroje na detekciu expresie a postranskripčných úprav tejto miRNA, a tým i jeho významu v zmysle diagnózy a prognózy vybraných nádorových ochorení, pre ktoré je miR-ZOa-Sp potenciálnym biomarkerom. Pomocou týchto syntetických oligonukleotidov je možné sledovať prítomnosť a nadbytok exprimovanej miR-ZOa-Sp.Oligonuldeotidy sú využiteľné najmä pri analýze expresie genomického úseku kódujúceho míR-ZOa-Sp pomocou kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie v reálnom čase (qPCR). Cieľom je detegovať prítomnosť a stanoviť množstvo miR-ŽOa-Sp vo vzorke pacienta, čo má význam na sledovanie stavu, diagnostiku a prognostiku ochorenia, ako aj odpovede na terapiu.MikroRNA (miRNA) sú jednovláknové nekódujúce RNA molekuly veľkosti 20 - 22 nukleotidov, ktoré sa zúčastňujú regulácie génovej expresie. Tieto molekuly typicky znižujú stabilitu mRNA najčastejšie vďaka interakcii medzi 5 koncom miRNA a 3 UTR (untranslated region) oblasti mRNA. Jednotlivé miRNA môžu takto ovplyvniť až stovky rôznych cieľových mRNA a ich účinok je veľmi komplexný. Rovnako rôznorodé sú aj procesy, ktoré miRNA v bunke ovplyvňujú. Sú to procesy zahrnuté v regulácii bunkového delenia, v odpovedi na stres, diferenciácii, zápalovej odpovedi a apoptóze. Pretože miRNA majú dôležitú úlohu vo vývojových procesoch, sú spojené aj so vznikom a vývojom nádorových ochorení.Jednou z takýchto dôležitých mikroRNA je aj mÍR-ZOa-Sp. miR-ZOa-Sp patrí medzi dôležité faktory, ktoré sú spojené s patogenézou rôznych typov ochorení vrátane nádorových.Zvýšená expresia miR-ZOa-Sp bola pozorovaná pri solídnych nádoroch (tráviaceho traktu, nosohltana, žalúdka, hrubého čreva), pri rakovine močového mechúra, pri viacerých lymfoproliferatívných ochoreniach,melanóme, pri rakovine prsníka, vaječníkov, krčka maternice, semenníkov, pri osteosarkóme a ďalších. Pacienti so zvýšenou expresiou miR-ZOa-Sp majú zvyčajne horšiu prognózu ochorenia. S nadprodukciou miR-ZOa-Sp je asociovaná aj rezistencia na chemoterapeutiká pri nádorových bunkách kolorektálneho adenokarcinómu.mÍR-ZOa-Sp ako súčasť miR-l 7-92 klastra priamo ovplyvňuje expresiu ďalších génov vrátane hlavného regulátora hematopoézy - tumorsupresorového transkripčného faktora PU.l. Medzi ďalšie ciele regulované miR-17-92 klastrom patria kľúčové tumor supresory, ako napr. inhibítor cyklín-dependentnej lcinázy(CDKNlA), transformačný rastový faktor beta 1 (TGFBI), pro-apoptický proteín BIM (Bcl 2 interagujúci mediátor bunkovej smrti) alebo tumor supresor PTE.Mechanizmus onkogenézy poukazuje na koreláciu zvýšenej regulácie expresie miR-ZOa-Sp a bunkovej proliferácie súvisiacej s genomickou amplifikáciou alebo vplyvom transkripčných aktivátorov ako c-MYC a EZFs, hypoxiou idukovanou apoptózou vyvolanou p-53 sprostredkovanou represiou. miR-ZO inhibuje c-Myc-indukovanú apoptózu a spúšťa c-Myc-sprostredkovanú lymfomagenézu inhibíciou expresie tumor supresorov.Pri miR-ZOa bol popísaný duálny regulačný účinok - môže pôsobiť ako onko miRNA (napr. pri nádore krčka maternice, vaječmkov) aj ako tumor supresor (napr. pri nádore prsníka, pečene a pod.). Takáto regulačná funkčná duálnosť môže súvisieť so špecificitou väzby miR-ZOa do 3 ° UTR oblasti cieľového génu.Ako príklad, kedy vznik patologického prejavu korešponduje s výskytom mikroRNA, môžeme uviesť vznik lymfoproliferatívnych ochorení. Pri týchto ochoreniach rôzne onkogénne mikroRNA inhibujú kľúčové hematopoetická transkripčné faktory. Hematopoéza (kwotvorba) je proces, kedy z kmeňových buniek sú tvorené bunkové komponenty krvi. Všeobecná schéma postupnej diferenciácie buniek v procese hematopoézy postupuje v poradí pluripotentná hematopoetická kmeňová bunka (HSC) - multipotentná/pluripotentná bunka - progenitorová bunka - prekurzorová bunka - úplne diferencovaná bunka. Krvotvomé bunky naprogramované na diferenciáciu lymfatických tkanív sú cieľom nádorového procesu vedúceho k lymfoproliferatívnemu ochoreniu, ktoré tvorí veľkú heterogénnu skupinu. Táto skupina zahŕňa ako leukémie (akútnu lymfoblastovú, chronické lymfatické leukémie), tak lymfómy a mnohopočetný myelóm. Celý proces diferenciá 10cie krvných buniek je riadený Veľkým počtom transkripčných faktorov a regulácia práve týchto transkripčných faktorov je podstatou pôsobenia onkogénnych mikroRNA, pričom miR-17-92 klaster zohráva výraznú úlohu.Ďalšími príkladmi pôsobenia miR-17-92 klastra je vznik nádorov pľúc, nádorov testes a prostaty, nádoru pankreasu, nádoru prsníka, krčka maternice, vaječníkov, tráviaceho traktu, nádorov obličiek a myeloproliferatívnych ochorení a melanómov.Všeobecne je známe, že hladina miRNA dobre korešponduje so vznikom a progresiou ochorenia a, čo je veľmi dôležité, miRNA sú stabilné a detekovateľné pomerne jednoduchými postupmi. Obe tieto vlastnosti je možné uplatniť v prípade využitia miRNA ako biomarkerov v diagnostických postupoch, kedy hladina miRNA napr. v kwi alebo plazme dobre reflektuje vývoj ochorenia a detekciu je možné uskutočniť klasickými zavedenými technikami, ako napr. RT-PCR. Kľúčovým krokom v takejto detekcii je správne navrhnutie komplementárnych oligonukleotidov, ktoré slúžia ako priméry v RT-PCR. Takéto oligonukleotidy sú predmetomOligonukleotidy syntetizovaué na detekciu výskytu a nadbytku miR-ZOa-Sp miR-ZOa-RTvo vzorkách pacientov, napr. z nádorových buniek alebo krvnej plazmy, sú určené na doplnenie diagnózy,stanovenie prognózy a odhadu potenciálnej efektivity liečby. Oligonukleotidy sú využiteľné najmä pri analýze expresie miR-ZOa-Sp pomocou kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie V reálnom čase (qPCR). Cieľom je detegovať prítomnosť a stanoviť množstvo miR-ZOa-Sp vo vzorke pacienta, čo má význam na sledovanie, predikciu či presnejšiu diagnostiku ochorenia, ako aj vhodné nastavenie terapie pacienta.Tieto syntetické oligonukleotidy je možné využiť ako priméry alebo ako sondy na spomínané aplikácie,eventuálne na ďalšie aplikácie založené na hybridizácii s Cieľovou (komplementárnou) sekvenciou nukleovej kyseliny vo vzorke pacienta.Pomocou fenol-chloroformovej extrakcie bola vyizolovaná totálna RNA zo vzorky krvnej plazmy. Kvalita RNA bola stanovená spektrofotometricky a pomocou Bioanalyzer 2100 (Agilent).Totálna RNA bola prepísaná do cDNA pomocou MuLV reverznej transkriptázy (RT) s predchádzajúcou polyadenyláciou 3 konca všetkých prítomných RNA pomocou poly(A) polymerázy (FAP). Zloženie RT-PAP reakcie Totálna RNA (100 ng),10 X poly(A) polymerázový pufer,0.1 mM ATP,l M RT-primér,0.1 mM každý z deoxynukleotidov (dATP, dCTP, dGTP, dTTP),100 U MuLV reverzná transkriptáza,1 U poly(A) polymeráza,Celkový objem reakcie 10 l.RT-PAP reakcia prebiehala pri teplote 42 °C počas 1 hodiny a následne bola ukončená inkubáciou pri teplote 95 °C počas 5 minút.Reakcie qPCR pozostávajúce z kombinácie špecifických forward a reverse primérov a vzoriek, s výhodným uskutočnením V jednom behu prístroja qPCR, je možné pripraviť nasledujúcim spôsobom(podľa Takara Sybr Premix) 10 l premixu qPCR pufra obsahujúceho Taq DNA polymerázu, dNTP a DNA-interkalujúce fluorescenčné farbivo na detekciu amplifikácie v reálnom čase, 1 l primérov (2500 nM každý), 2 l cDNA (10 X nariedená cDNA z RT-PAP kroku), 7 l vody.Schéma PCR reakcie na uskutočnenie 30 - 45 cyklov je možné nastaviť nasledujúcim spôsobom a) po počiatočnej denaturácii 60 sekúnd pri teplote 95 °C, nasleduje 30 - 45 cyklov samotnej amplifikácie,b) 10 sekúnd denaturácie pri teplote 95 °C,c) 10 - 20 sekúnd hybridizácie (annealing) primérov k templátu pri teplote 60 °C,d) 6 - 15 sekúnd amplifikácie amplikónov pri teplote 72 °C.Konkrétne hodnoty časových intervalov sa musia optimalizovať pre konkrétny typ prístroja použitého pre qPCR. Každý beh musí obsahovať samostatnú kalibračnú krivku pre každý oligonukleotid. Hodnoty Cq sa odčítavajú podľa návodu na použitie príslušného prístroja pre qPCR a vyhodnotia sa nasledovneVýsledky z meraní qPCR vo forme Cq hodnôt (alebo Ct hodnôt, alebo Cp hodnôt) vzoriek cDNA jednotlivých pacientov a zvolených primerov sú spracované delta-delta-Cq-metódou a výsledkom je relatívna hodnota FC (fold change), ktorá sa vzťahuje k vybranému kalibrátoru.Oligonukleotidy sú využiteľné najmä pri analýze expresie klastra miR-l 7-92 pomocou kvantitatívnej polymerázovej reťazovej reakcie v reálnom čase (qPCR) na detekciu prítomnosti a nadbytku vlastnej miR-ZOa-Sp vo vzorke pacienta. Stanovenie hladiny miR-20 a-5 p umožňuje diagnostikovať, predikovat a sledovat patogenézu najmä týchto ľudských ochorení lymfoproliferatívne a myeloproliferatívne ochorenia, nádory prsníka, vaječníkov, maternice, semenmkov, prostaty, žalúdka, hrubého čreva, pečene, obličiek a iných. Tieto syntetické oligonukleotidy sú kľúčové ako priméry na spomínané aplikacie alebo eventuálne ako sondy na ďalšie aplikácie založené na hybridizácii s Cieľovou (komplementárnou) sekvenciou nukleovej kyseliny vo vzorke pacienta.Oligonukleotidy určené na detekciu miR-ZOa-Sp, v y z n a č u j ú c e s a t ý m , že majú nasledovné sekvencie baz

MPK / Značky

MPK: C12N 15/115, C12Q 1/00, C12Q 1/68, G01N 33/50, G01N 33/574

Značky: oligonukleotidy, detekciu, mir-20a-5p, určené

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-u7157-oligonukleotidy-urcene-na-detekciu-mir-20a-5p.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Oligonukleotidy určené na detekciu miR-20a-5p</a>

Podobne patenty