Spôsob výroby frakcie s inaktivovanými vírusmi obsahujúcej faktor VIII

Číslo patentu: 284215

Dátum: 13.10.2004

Autori: Josic Djuro, Stadler Monika Andrea, Strancar Ales

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný spôsob výroby frakcie s inaktivovanými vírusmi obsahujúcej faktor VIII, pri ktorom sa v roztopenom kryoprecipitáte alebo krvnej plazme po prípadnom spracovaní hydroxidom hlinitým inaktivujú vírusy pôsobením di- alebo trialkylfosfátu a neiónového povrchovo aktívneho činidla a potom sa vzniknutá frakcia podrobí aspoň jednej separačnej operácii pri použití membránovej chromatografie na membránach alebo kompaktných diskoch z poréznych hydrofilných polymérov zvolených z polyglycidylmetakrylátov alebo hydrofilizovaného polystyrénu. Okrem inaktivácie vírusov sa prednostne uskutočňuje tiež prídavná pasterizácia.

Text

Pozerať všetko

(22) Dátum podania prihlášky 30. 9. 1994(24) Dátum nadobudnutia (51) Im C 175 účinkov patentu 3. 11. 2004 Vestník UPV SR č. 11/2004 C 07 K 1/18(3 l) Číslo prioritnej prihlášky v 43 37 573.1 C 07 K V 20(32) Dátum podania prioritnej prihlášky 4. 11. 1993 C 07 K U 22, . , C 07 K 14/755 URAD (33) Krajmaalebo regionalna A 611( 38/37 pRIEMYSELNÉHO organizacia priority DE VLASTNICTVA (40) Dátum zverejnenia prihlášky 2. 10. 1996 SLOVENSKEJ REPUBLIKY Vestník ÚPV SR č. 1011995(62) Číslo pôvodnej prihlášky V prípade vylúčenej prihlášky(86) Číslo podania medzinárodnej prihlášky podľa PCT PCT/EP 94/03258(87) Číslo zverejnenia medzinárodnej prihlášky podľa PCT W 095/12609(72) Pôvodca Strancar Ales, Ajdovscina, Sl Stadler Monika Andrea, Wienerherberg, AT Josic Djuro, Dr., Wien, AT(54) Názov Spôsob výroby frakcie s inaktivovanými vírusmi obsahujúcej faktor VIIIJe opísaný spôsob výroby frakcie s inaktivovanými vírusmi obsahujúcej faktor VIII, pri ktorom sa v roztopenom kryoprecipitáte alebo krvnej plazme po prípadnom spracovaní hydroxidom hlinitým inaktivujú vírusy pôsobením di- alebo trialkylfosfátu a neiónového povrchovo aktívneho činidla a potom sa vzniknutá frakcia podrobí aspoň jednej separačnej operácii pri použití membránovej chromatograíie na membránach alebo kompaktných diskoch z poréznych hydrofilných polymérov zvolených z polyglycidylmetakrylátov alebo hydroñlizovaněho polystyrénu. Okrem ínaktivácie vírusov sa prednostne uskutočňuje tiež prídavné pasterizácia.vynález sa týka spôsobu výroby frakcie s inaktivovanými vírusmi obsahujúcej faktor VIII chromatograñckými metódami.Faktor VIII je životne dôležitá látka, ktorá má dôležitú úlohu pri zrážaní krvi. Poruchy zrážavosti krvi je teda možné liečiť podávaním faktora VIII. Preto existuje veľká potreba farmaceutických prípravkov obsahujúcich faktor VIII,ktoré by boli vhodné na podávanie pacientom. Bol uskutočnený rad pokusov o izoláciu faktora Vlll vo vysoko obohatenej forme z prírodných zdrojov. Sú už známe chromatografické metódy puritikácie faktora VIlI z kiyoprecipitátov. Kryoprecipitát je frakcia, ktorú je možné získať spracovaním plazmy za chladu. EP 367 840 B 1 sa týka chromatografického spôsobu izolácie faktora VIII z krvnej plazmy bez predbežnej kryoprecipitácie. Frakcia obsahujúca faktor VIII sa oddeľuje chromatografickou separáciou na hydroñlnom chromatografickom materiáli, ktorý je modifikovaný skupinami meniacími ióny. EP 0 238 701 sa týka spôsobu výroby ultračistého infekčného antihemoñlického faktora, pri ktorom sú predbežne upravené frakcie tvorené kryoprecipitátom zbaveným fibrinogćnu, globulínu, albumínov a iných rušivých zložiek zrážaním etanolom. V európskej patentovej prihláške č. 88 108 458.6 je opísaná chromatograñcká separácia pomocou ionexov, ktorej sa podrobuje frakcia kryoprecipitatu po inaktivácii vírusov. V EP O 173 242 A je opísaný spôsob získavania prípravkov obsahujúcich faktor V 111 chromatograñou na anexových materiáloch, ktoré sú výhradne založené na uhľohydrátoch,pričom uhľohydrátová matrica je modifikovaná skupinami DEAE. Ako užitočné materiály sú opísané predovšetkým DEAE Sepharose a DEAE celulóza. V GB-A-l 178 958 je opísaná purifikácia faktora VIlI pri použití kolón naplnených ECTEOLA celulózou. Táto modifikovaná celulóza obsahuje bázické substituenty zavedené reakciou s epichlórhydrínom a trietanolamínom. Pri opísaných postupoch známych z doterajšieho stavu techniky sa využíva diskontinuálna chromatografická separácia alebo stlpcová chromatografia. Napriek tomu, že sa týmito spôsobmi dosahujú dost dobré výsledky, stále pretrváva potreba z ekonomických a etických dôvodov zvýšiť výťažky biologicky hodnomého faktora VIll.V EP-A-O 286 323 je opísaný spôsob čistenia polypeptidov pomocou imobilizovaných protilátok. Sú tu tiež opisané ďalšie purifikačné stupne vykonávané na celulózových membránach modifikovaných anexami. Opísanýin postupom je tiež možné purifikovat faktor VIII.Úlohou tohto vynálezu je teda vyriešiť technický problém spočívajúcí vo vyvinutí spôsobu, ktorý vychádza z doterajšieho stavu techniky, ale umožňuje zlepšenú prípravu faktora V 111, pokial sa týka výťažkov a biologickej účinnosti.S prekvapením bol tento problém vyriešený spôsobom podľa vynálezu. Predmetom vynálezu je spôsob výroby frakcie s inaktivovanými vírusmi obsahujúcej faktor Vlll,ktorého podstata spočíva v tom, že sa v roztopenom kryoprecipitáte alebo krvnej plazme po prípadnom spracovaní hydroxidom hlinitým inaktivujú vírusy pôsobením di- alebotrialkylfosfátu a neiónového povrchovo aktívneho činidla a potom sa vzniknutá frakcia podrobí aspoň jednej separačnej operácii pri použití membránovej chromatograñe na membránach alebo kompaktných diskoch z poréznych hydrofilných polymérov zvolených z polyglycidylmetakrylátov alebo hydrofilizovaného polystyrénu.Spôsob podľa vynálezu sa môže realizovať pri použití obchodne dostupného kryoprecipitátu alebo krvnej plazmy. Roztopený kryoprecipitát sa prednostne spracováva hydroxidom hlinitým na účely ďalšej predbežnej puríñkácie vzorky, ktorou sa predbežne zvýši koncentrácia faktora VIII.Inaktivácia vírusov sa vykonáva pred vlastnou chromatografickou purifikáciou na materiáloch, ktoré sú usporiadané v alebo na membránach. Inaktivácia vírusov sa pritom uskutočňuje spôsobom opísaným v EP 131 740 Al pomocou spracovania biokompatibilnými organickými rozpúšťadlami (detergentmi), zmesou Tritonu® X-100 a tri-n-butylfosfátu (TNBP), prednostne zmesou Tweenu® a TNBP. Dobré výsledky sa dosahujú tiež pri použití zmesi cholátu sodného a TNBP. Detergenty sa prednostne používajú v množstvách do 15 hmotnostných.Chromatografický separačný stupeň na puriñkáciu faktora VIlI vo vzorke sa môže vykonávať bud na základných materiáloch modifikovaných skupinami meniacirrij ióny, predovšetkým na anexoch, alebo pri použití materiálov modifikovaných imunoañnitnými ligandami. Pritom je rozhodujúce, že uvedene materiály musia byt usporiadané do podoby membrán. Tieto membrány a kompaktné disky sú zhotovené z poréznych poly-(glycidylmetakrylátov) a/alebo z hydrofilizovaného polystyrénu.Membrána vhodná na delenie sa skladá z kompaktných diskov zhotovených z polymémych nosičov. Základné materiály membrán alebo diskov sú vybavené zodpovedajúcimi skupinami meniacimi anióny alebo imunoafinitnými ligandami. Ako ionexové skupiny prichádzajú do úvahy predovšetkým skupiny meniace anióny, ako sú skupiny kvartémych amínov alebo dietylaminoetylskupiny. Vhodnými katexami sú predovšetkým v podstate slabo a silne kyslé meniče katiónov, ako sú materiály, ktoré sú modifikované sulfónovými skupinami alebo skupinami kyseliny fosforečnej.Skupiny meniace ióny môžu byt pripojené k vláknam základného materiálu prostredníctvom tzv. medzemíkov(spacerov) alebo bez nich. Materiály obsahujúce spacery sa tiež označujú názvom tentaklové (tykadlové) materiály. Zodpovedajúce spacery a Iigandy sú uvedené v DE 42 04 694. Ako spacer môže tiež napríklad slúžiť glukózamínový zvyšok. Skupiny meniace anióny, ak sú DEAE alebo skupiny kvartémych amínov, môžu byt tiež pripojené k membránam zhotoveným z porézneho poly(glycidylmetakrylátu) alebo iných uvedených materiálov. Skupiny meniace anióny môžu byt pritom pripojené bud priamo k membránotvomému materiálu alebo tiež prostredníctvom spaceru,napríklad glukózaminového zvyšku.Podľa ďalšieho rozpracovania spôsobu podľa vynálezu sa používa afinitná membránová Chromatografia s imobilizovanými látkami, ktoré majú vysokú afinitu proti faktoru VIII.Látky majúce añnitu proti faktoru VIII sa na nosičoch imobilízujú prostrednictvom chemicky reaktívnych skupín. Také reaktíwie skupiny prednostne atakujú koniec spaceru a nie priamo nosičový materiál. Imobilizácia látok pre faktor VIll sa vykonáva prostredníctvom väzby k reaktíwiym skupinám ako je tozylová, trezylová alebo hydrazidová skupina a iné. Zodpovedajúce postupy sú známe z T. M.Phillips Afinity Chromatography v ChromatographyPodľa iného prednostného uskutočnenia sa na separácíu faktora VIII používajú materiály, ktoré sú schopné zaistiť hydrofóbnu interakciu. Ako hydrofóbne materiály sa používajú acyklické a/alebo cyklické alkylové reťazce, napríklad alkylové reťazce s 1 až 18 atómami uhlíka, a aromaticke látky. Vhodné materiály poskytujúce hydrofóbnu interakciu prednostne zahŕňajú látky s odstupňovanou hydrofobicitou. Hydrofobicitu je možné odstupňovat zavedením polámych skupín, ako sú protické poláme alebo aprotické poláme skupiny, napríklad hydroxyskupiny, aminoskupiny a kyanoskupiny. Prednostne sa toto odstupňovanie hydrofobicity vykonáva s ohľadom na príslušné separačne podmienky.naktivácia vírusov sa tiež môže vykonávať spracovaním teplom. Prednostne sa pritom postupuje tak, že sa eluovaná vzorka obsahujúca faktor VIII spracováva v pasterizačnom stupni po prvom membránovom chromatografickom stupni, Zodpovedaj úci postup je navrhnutý v DE-A-43 18 435.9. Pritom sa frakcie obohatené faktorom VIII uvádzajú do styku s di- alebo trialkylfosfátmi a prípadne s namáčadlami v prítomnosti stabilizátorov a súčasne alebo následne sa na nich pôsobí počas 5 hodín až 30 hodín zvýšenými teplotami v rozmedzí od 55 do 67 °C. Môže byt výhodné kombinovat obidve tieto metódy inaktivácie vírusov,t. j. spracovanie detergentmi a pôsobenie tepla.Na odstránenie chemikálií použitých v pasterizačnom stupni môže nasledovať druhá membránová chromatografia. Oddeľovanie pridaných stabilizátorov sa prednostné uskutočňuje pomocou membrány modífikovanej DEAE alebo kvartémymi amóniovými zlúčeninami, ktoré sú usporiadané na povrchu chromatografického nosičového materiálu pri použití spacerov. Zodpovedajúce ligandy je možne usporiadať na povrchu nosičového materiálu tiež bez použitia spacerov. Za zvolených podmienok nie sú stabilizátory týmto anexovým materiálom retardované, zatial čo faktor VIII sa adsorbuje na chromatografickom materiáli.Potom sa faktor VIII eluuje vodným rozpúšťadlovým systémom s postupne vzrastajúcimi koncentráciami soli.Frakcia obsahujúca faktor VIII, ktorá sa takto získa, sa skoncentruje, naplní do vhodných nádob a prípadne konvenčnými spôsobmi lyofilizuje.V prvom membránovom chromatografickom separačnom stupni sa faktor VIII prednostne aplikuje z roztoku s nízkou iónovou silou. Vodný systém má prednostne iónovú silu, ktorá zodpovedá roztoku chloridu sodného s O až 150 mM koncentráciou. Pri takej iónovej sile sa faktor VIII ešte adsorbuje na chromatografickom materiáli, zatiaľ čo nečistoty, ktorć sa viažu slabšie, je možné vymyt pri použití vodného systému s rovnakou iónovou silou.Podľa ďalšieho rozpracovania spôsobu podľa vynálezu sa purifikácia adsorbovaného materiálu môže vykonávať pri použití vodného systému s iónovou silou zodpovedajúcou 200 až 400 mM roztoku chloridu sodného. Desorpcia faktora VIII a elúcia tejto frakcie sa potom uskutočňujú vodným systémom s iónovou silou zodpovedajúcou 500 až 150 mM roztoku chloridu sodného, pričom hodnota pH sa udržuje v rozmedzí od 4 do 9. Pokiaľ sa vykonáva chromatograña, prednostne prebieha pri pH nižšom ako 6, zatiaľ čo anexová chromatograña sa vykonáva skôr pri vyšších hodnotách pH, nad 6.Pokiaľ sa puriñkácia faktora VIII vykonáva imunoañnitnou membránovou chromatografiou, potom sa na rozdiel od opísaného spôsobu pri použití anexových materiálov,uskutočňuje elúcia chaotropickými činidlami alebo vysoko koncentrovanými soľnými roztokmí. Prednostne sa elúciavykonáva s takými koncentráciami chaotropických činidiel alebo soli, ktoré postačujú na rozbitie väzby medzi látkou s vysokou afinitou k faktoru VIII a faktorom VIII. Koncentrácia uvedených látok V konkrétne použitých elučných systémoch závisí od intenzity afinity medzi faktorom VIII a zodpovedajúcou väzbovou zložkou. V dôsledku toho sa elúcia môže vykonávať vodnými roztokmi s nižšou denaturačnou schopnosťou. Prednostne sa na elúciu faktora VII z imunoaíinitnej membrány používajú vodné roztoky močoviny s koncentráciou 1 až 6 M, najmä s koncentráciou 2 až 4 M alebo zodpovedajúce vysoko koncentrované roztoky soli.Pri hydrofóbnej interakčnej chromatografii sa vzorka aplikuje z vodného roztoku s veľmi vysokou iónovou silou,napríklad z vysoko koncentrovaného roztoku síranu amónneho (až do koncentrácie 4 M) alebo chloridu sodného (až do koncentrácie SM). Elúcia sa predovšetkým vykonáva postupne alebo kontinuálne soľnými roztokmi s nižšou iónovou silou. Ako roztoky s nižšou iónovou silou na elúciu vzoriek pri hydrofóbnej interakčnej membránovej chromatograñi sa tiež môžu použit vodné roztoky s organickými rozpúšťadlami, predovšetkým zriadené alkoholické roztoky.Spôsob podľa vynálezu s prekvapením zaisťuje rýchlu a nekomplikovanú purifikáciu faktora VIII, ktorý sa získava súčasne s vysokou čistotou a vo vysokom výťažku. Okrem toho, špecifická aktivita faktora VIII získaného týmto spôsobom je dost vysoká, čo je možné vysvetlit nízkou denaturáciou aktívneho faktora pri spôsobe podľa vynálezu.1. Spôsob výroby frakcie s inaktivovanými vírusmi obsahujúcejfaktorVIll, vyznač uj úci sa tým,že sa v roztopenom kryoprecipitáte alebo krvnej plazme po prípadnom spracovaní hydroxidom hlínitým inaktivujú vírusy pôsobením di- alebo trialkylfosfátu a neiónového povrchovo aktíwieho činidla a potom sa vzniknutá frakcia podrobí aspoň jednej separačnej operácií pri použití membránovej chromatograñe na membránach alebo kompaktných diskoch z poréznych hydrofilných polymérov zvolených z polyglycidylmetakrylátov alebo hydrofilizovaného polystyrenu.2, Spôsobpodľanároku l, vyznačujú ci sa t ý m , že sa separačná operácia vykonáva na ionexovom materiáli, predovšetkým anexovom materiáli, ktorý je usporiadaný v alebo na membráne.3. Spôsob podľa nároku 1 a/alebo 2, v y z n a č u j ú ci s a tý m , že sa ďalšia inaktivácia vírusu uskutočňuje v pasterizačnom stupni, po ktorom prípadne nasleduje prídavná separačná operácia pri použití membránovej chromatografie.4. Spôsob podľa niektorého z nárokov l a/alebo 3,vyznačujúci sa tým, že sa membránová Chromatografia vykonáva na materiáli, ktorý má vysokú afinitu k faktoru VIII.5. Spôsob podľa niektorého z nárokov l a/alebo 4,vyznačujúci sa tým, že materiál svysokou afinitou k faktoru VIII je modifikovaný ligandami s vysokou a/alebo nízkou molekulovou hmotnosťou.6. Spôsob podľa nároku 4 a/alebo 5, v y z n a č u j ú c í s a t ý m , že modífikovaný materiál, ktorý má vysokú añnitu k faktom VIII, nesie imobílízované ligandy s vysokou afmitou k faktoru VIII.7. Spôsob podľa niektorého z nárokov l a/alebo 3,vyznačuj úcí sa tým, že chromatografickýmateriál umožňuje hydrofóbnu interakciu s faktorom VIII,ktorý má byt oddelený, alebo nesie vhodné ligandy, ktoré túto hydrofóbnu interakciu sprostredkovávajú.8. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 3, V y značuj úci sa tým, že sa vzorka, ktorá má byť puriñkovaná, nanáša vo vodnom systéme s nízkou iónovou silou zodpovedajúcou 0 až 150 mM roztoku chloridu sodnćho na membránu obsahujúcu ionexovú látku, pripadne sa premýva vodným systémom s vyššou iónovou silou zodpovedajúcou 200 až 400 mM roztoku chloridu sodnćho a potom sa eluuje vodným systémom s vysokou iónovou silou zodpovedajúcou S 00 až 1 500 mM roztoku chloridu sodného, pričom hodnota pH sa udržuje v rozmedzí od 4 do 9.9. Spôsob podľa niektorého z nárokov l, 3 a/alebo 7,vyznačujúci sa tým, že sa vzorka, ktorá má byt puriñkovaná, nanáša z roztoku s veľmi vysokou iónovou silou na membránu nesúcu na svojom povrchu hydrofóbne ligandy a eluuje sa rozpúšťadlovými systémami s nižšou iónovou silou.10. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 9, v y značuj úci sa tým, že sa eluovaná írakcia obsahujúca faktor VIII koncentruje, plní do vhodných nádob a/alebo lyoñlizuje.11. Spôsob podľa niektorého z nárokov l až 10, v y značuj úci sa tým, žesainaktivàciavírusov vykonáva pôsobením až 15 hmotnostný/ch detergentu.

MPK / Značky

MPK: C07K 1/18, C07K 1/20, C07K 14/755, C07K 1/22, A61K 38/37

Značky: výroby, frakcie, inaktivovanými, faktor, vírusmi, spôsob, obsahujúcej

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-284215-sposob-vyroby-frakcie-s-inaktivovanymi-virusmi-obsahujucej-faktor-viii.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob výroby frakcie s inaktivovanými vírusmi obsahujúcej faktor VIII</a>

Podobne patenty