Glykoproteíny bohaté na hydroxyprolín, kozmetické a farmaceutické prostriedky s ich obsahom

Číslo patentu: 280572

Dátum: 10.12.1997

Autori: Ponzone Cesare, Bombardelli Ezio

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Sú opísané glykoproteíny bohaté na hydroxyprolín, ktoré sa môžu získať extrakciou alkoholom z kyslého prostredia z buniek kultúr Taxus spp., Gingko biloba, Lycopersicum esculentum a Daucus carota a majú nasledovné vlastnosti: priemernú molekulovú hmotnosť 20 000 daltonov s intervalom hodnôt od 12 000 do 38 000 daltonov
molekulová hmotnosť sa stanovovala gélovou permeáciou a elektroforézou
ďalej sú vysoko rozpustné vo vode.

Text

Pozerať všetko

Dátum podania 31.12.1995 (13) Druh dokumentu B 6 Číslo prioritnej prihlášky MI 94 A 002663 (51) Int. Cl 63 Dátum priority 28.12.1994 C 121) 21/00 Krajina priority IT Ž Dátum zverejnenia 10.12.1997 A ÓÍK 7/48 ÚRAD PRIEMYSELNÉHO Dátum zverejnenia udelenia VLASTNÍCTVA vo Vestníku 13.03.2000 SLOVENSKEJ REPUBLIKYČíslo PCT PCTlEP 95/05084, 21.12.1995(73) Majiteľ patentu Indcna S.p.A., Milano IT(72) Pôvodca vynálezu Bombardelli Ezio, Milano, IT Ponzone Cesare, Milano, IT(54) Názov vynálezu Glykoproteíny bohaté na hydroxyprolín, kozmetické a farmaceutické prostriedky s ich obsahomSú opísanć glykoproteíny bohaté na hydroxyprolín, ktoré sa môžu získať extrakciou alkoholom z kyslćho prostredia z buniek kultúr Taxus spp., Gingko biloba,Lycopersicum esculentum a Daucus carata a majú nasledowié vlastnosti priememú molekulovú hmotnosť 20 000 daltonov s intervalom hodnôt od 12 000 do 38 000 daltonov molekulová hmotnosť sa stanovovala gćlovou penneáciou a elektroforézou ďalej sú vysoko rozpustné vo vode.Vynález sa týka proteínov bohatých na hydroxyproín,ktoré možno získať z rastlinných zdrojov, ďalej sa týka ich farmaceutického a kozmetického použitia.Podrobnejšie sa tento vynález týka proteínov bohatých na hydroxyproín, ktoré sa môžu získať extrakciou alkoholom z kyslého prostredia z buniek kultúr Taxus spp., Gingkn biloba, Lycapersicum esculenrum a Daucus carota a majú nasledovné vlastnosti- priememú molekulovú hmotnosť 20 000 daltonov s intervalom hodnôt od 12 000 do 38 000 daltonov, stanovovanú gélovou permeáciou a elektroforézouNiektoré glykoproteíny živočíšneho pôvodu, ako je kolagén a proteoglykány sú známe tým, že samotné alebo zabudované vo vhodných formuláciách majú pri topikálnej aplikácii priaznivý účinok na pokožku.Kolagén, ktorý je glykoproteín bohatý na prolín a hydroxyprolín sa používa najmä samotný, alebo v kombinácii s ďalšími polypeptidovými bázami na liečbu vrások a ďalších estetických chýb, súvisiacich so zlou hydratáciou a slabou elastickosťou pokožky. Živočišny pôvod kolagénu však obmedzuje jeho použitie tým, že nie je vylúčené nebezpečie kontaminácie vírusmi a toxínmi. Hoci uvedené zlúčeniny rastliného pôvodu nemajú tento nedostatok, doteraz ich použitie v kozmetike bolo celkom obmedzené sú známe napríklad kozmetické formulácie, ktoré obsahujú surové extrakty rastlín, ako je Aloe, alebo obsahujú celkom na drobno posekané rastliny, ako je avokado.Sú známe rastlinné glykoproteíny, označované ako extenzíny, ktoré sú produkované v rastlinných bunkách v štádiu proliferacie a ktoré majú podobnú stavbu ako živočíšny kolagén. EP-A-0 533 4078 zverejňuje kozmetické použitie extenzinov, ktoré majú priememú molekulovú hmotnosť viac ako 100 000 daltonov. Doteraz opísovaný spôsob extrakcie, ktorý pozostáva z extrakcie rastlinných materiálov rôzneho pôvodu pomocou vodných soľných roztokov, nasledovaný čistením silnými kyselinami ako je kyselina trichlóroctová, neumožňujú však získať vhodné produkty pre kozmetiku v dôsledku ťažkostí spojených s nedostatočnou rozpustnosťou, stálosťou, opakovateľnosťou a konzistenciou ich chemicko-fyzikálnych vlastností.Teraz sa zistilo, že možno získať proteíny bohaté na hydroxyproín, štruktúme podobne už opísaným extenzinom, ktoré majú nižšiu molekulovú hmotnosť a vyššiu rozpustnosť V kyslých vodných roztokoch. Môžu sa získať spôsobom zahŕňajúcim kultiváciu buniek in vitro vybraných rastlín a extrakeiou buniek rozmnožených vo vhodnom médiu. Extrahuje sa alkoholickými kyslými roztokmi.Glykoproteíny získateľné zhodne s týmto vynálezom majú lepšie hydratačné, filmotvomé, tonizujúce a hojivé vlastnosti ako kolagén. Uvedené glykoproteíny podľa tohto vynálezu preto možno vymžiť v kozmetických alebo dermatologických formulaciach na liečbu suchej pokožky,psoriázy, ichtyózy, lupín, kartózy, vrások, akné, ekzémov,zápalových dermató stamutia pokožky a vo všetkých ďalších aplikáciách, pre ktoré je navrhovaný živočíšny kolagen.Vodné roztoky glykoproteínov podľa tohto vynálezu sú stale, pretože V nich nenastáva polymeriúcia glykoproteíno v, ktorá vedie k vzniku nerozpustných produktov. Vodné roztoky ďalej majú vysokú viskozitu a nezávislú od koncentrácie 0,1 -ne koncentrácie roztokov prekvapivo majú rovnakú filmotvomú a hydratačnú mohutnosť ako l -ný ro tok kolagénu alebo 5 Vo-ný roztok rastlinného albumínu.Extrahovateľný rastlinný materiál sa získa z fcrmentovaných kultúr buniek Taxus spp., Gingko biloba, Lycopersivum esculentum a Daucus carota. Použitie buniek Taxus spo., Gingko biloba a Lycopersicum esculentum je osobitne výhodné. Technika kultivácie buniek je bežná a zahŕňa suspenznú kultiváciu, vychádzajúc z kalusových kultúr z rô mých častí rastlín, ako sú listy, kôra, korene, kmeň alebo semená, ako to opisujú autori Dobbs a Roberts v Experimcnts in Plant Tissue Culture, 2. vydanie, Cambridge University Press, New York, 1985.Na zaočkovanie vhodných tekutých médií sa typicky v) užívajú rastlinné tkaniva z kalusu, po sterilizácii a voliteľnej prísade antibakteriálnych látok, ako to opisujú už spomenutí Dobbs a Roberts. V tomto vynáleze je vhodné médium, najmä médium podľa Murashige a Skooga. Na zvýšenie produkcie vyžadovaných glykoproteínov môže byt vhodný prídavok niektorých prísad, ako je prolín, redukčné látky, etylén alebo zlúčeniny schopne uvoľňovať etjxlćn, ako je Ethepon alebo kyselina L-aminocyklopropánkarboxylová.Výhodnáje prísada nañylaoctovej kyseliny ako auxínu,6-jr,r-dimetylamino)-purínu ako cytokinínu, vitamínov a 3 M sacharóza ako zdroj uhlíka. Na zamedzenie hnednutia krnečného produktu môže byť v závislosti od vybraného m rteriálu vhodný prídavok vitamínu C.Čas fermentácie sa môže meniť od 3 do 12 dní, výhodne S až 6 dni. Po ukončení fermentácie sa kultivačné prostrrdie odstredí a bunková hmota sa extrahuje pomocou alkc holov, výhodne etanolom, za prítomnosti zriedených mínerálnych kyselín, výhodne kyseliny chlorovodíkovej alebo kyseliny sírovej. Uvedený postup deaktivuje niektoré enzý my, ktoré môžu nepriaznivo ovplyvňovať stálosť glykoproteínov podľa tohto vynálezu, najmä polyfenoloxidazu a ty ~ozínovú oxidázu, ktoré podporujú polymerizáciu glykoproteínov s následným vznikom nerozpustných produktov.Extrakcia alkoholom za prítomnosti minerálnych kyselír umožňuje úplnú extrakciu zásaditých glykoproteínov a navyše sa ukázala ako mimoriadne selektívna. Popri etanc le sa môžu použiť aj iné s vodou miešateľné alkoholy, akr je metanol alebo izopropanol. Výsledné vodnoallzoholové extrakty sa neutralizujú a potom sa skoncentrujú a zahrievajú na teplotu od 70 do 100 °C, výhodne okr lo 80 °C až do úplného vyzrážania denaturovaných prote nov. Suspenzia sa nechá vyčiriť a kvapalná časť sa podrobí frakčnej ultrafiltrácii na odstránenie látok s vysokou a ní akou molekulovou hmotnosťou. Ultrafiltráeia sa vykoná s použitím polysulfónových membrán, ktoré majú separačnúhranu 100 00 až 400 00 daltonov, ako sú CentriconR aleboRnmiconR, v ktorých môžu byť duté vlákna alebo alternatívne vlákna skrútené. Výsledný sfiltrovaný produkt sa elektrodialyzuje na odstránenie nežiaducich látok, ako sú sc li a cukry s nízkou molekulovou hmotnosťou. Po ñltracii a dialýze sa výsledný roztok môže použiť samotný v kozmstike alebo do farmaceutických prípravkov, alebo sa môže skoncentrovať na menší objem a potom lyofylizovať ale no atomizovať.Analytická charakterizácia produktov podľa tohto vynž-lezu sa vykonala gélovou permeáciou s použitím vysokotlakového kvapalínového chromatografu, pozostávajúceho z jednotky čerpadla Waters a vybaveného kolónovoubatériou Ultrahydrogel Linear WatersR 30 cm x 0,5 cm,UV a absorpčným detektorom Waters, modelom 484. Vodný roztok s koncentráciou 0,067 molov dihydrogenfosfo rečnanu draselného, 0,1 molu NaCl a 6 . 104 molov NaN 3v 1 dm 3 vody sa použil ako eluačné činidlo. Analyzovarié glykoproteínové vzorky sa rozpustíli v uvedenom eluačnom činidle (3 mg v l 0 ml) v odstupňovaných množstvách a rovnako aj refrenčné látky, vybrané podľa molekulovej hmotnosti medzi Cytochrómom C (12 400 daltonov) a dextránovou modrou (2000 000 daltonov) alternatívne alebo súčasne sa elektroforézou na 12,5 Vo-nom polyakrylamidovom gćli a 4 -nom stacking géli môžu stanoviť produkty alebo ich medziprodukty. Analyzované vzorky sa rozpustia v tlmivom roztoku, obsahujúcom SDS a 0,1 Vo-ný merkaptoetanol pri zachytených množstvách medzi 100 a 300 mg. Migrácia sa vykoná pri konštantnom prúde 20 mA počas 4 hodín. Kalibračnà krivka sa zhotoví pomocou 5 štandardných hmotnosti (7 kD, 14 kD, 24 kD, 54 kD a 66 kD). Pre dva hlavné pásy sa z tejto kalibračnej krivky vypočítajú hmotnosti 22,5 kD a 25 kD, pre menej intezivne pásy hmotnosti 31 kD a 34 kD. Aj ked sa vychádza z odlišných rastlín, umožňuje tento postup získať z rôznych bunkových explantátov zmesi produktov s porovnávateľnými molekulovými hmotnosťami a poromávateľným zastúpením aminokyselín. Výsledky analýzy aminokyselín glykoproteínov, extrahovaných z buniek Gingka biloba ako príklad súUvedené údaje sú percentá z celkového obsahu aminokyselín, prítomných v zmesi glykoproteínov. V zmesi sú cukry arabinóza a galaktóza. Pomer aminokyselín k cukrom v rôznych produktoch je priemerne 2 l.Ako už bolo uvedené, produkty podľa tohto vynálezu sa môžu použiť tak V oblasti farmácie, ako aj v oblasti kozmetiky. V oblasti farmácie sa produkt môže zabudovať do gélov alebo mastí, alebo sa môže naniesť na liečivé gázy na špecifickú liečbu popálenín alebo poranení. V týchto prípadoch sa výrobok zvyčajne podrobí sterilízácii alebo sterilizačnej ñltrácii a lyoñlizácií.Kozmetické a dermatologické prípravky podľa tohto vynálezu sa môžu pripraviť zaužívanými spôsobmi. Príklady užívateľských foriem zahŕňajú vodné spreje, vody, roztoky, emulzie, gély, mastí a krémy.Kozmetické a dermatologické prípravky podľa tohto vynálezu môžu obsahovať glykoproteíny bohaté na hydroxyprolín v hmotnostnom zastúpení od približne 0,0 l do približne 50 , výhodne od 0,05 do 5 , ako aj zvyčajneprísady a prídavné látky. Vďaka vysokej stálosti glykoproteínov z tohto vynálezu sa môžu dosiahnuť farmaceutické a kozmetické prípravky, obsahujúce vyše 50 rozpustných glykoproteínov bohatých na hydroxyprolín.Uvedené glykoproteiny z tohto vynálezu sa môžu pridať do farmaceutických a kozmetických prípravkov sarnotné, alebo sa môžu pridávať mikroenkapsulované tak, že poskytujú predĺžený hydratačný účinok. Mikrokapsuly môžu byť alebo hydrofilné, alebo lipofilné. Prípravky podľa tohto vynálezu môžu zahŕňať ďalšie účinné zložky, ktore majú na vyžadovaný účel doplnkový alebo podpomý účinok.Vynálezje ďalej objasňovaný pomocou príkladov.Príklad 1 Príprava kalusu a tekutej kultúry z Gínkga biloba na prípravu glykoproteínovExplant mladých listov Gíngko biloba sa pripraví pre mývaním listov v 0,1 Vo-nom roztoku Tween SOR. Listy sa rozrezali na kúsky s veľkosťou asi 0,5 cm a predsterilizovali l minútu so 75 -ným etanolom. Sterilizácia sa potom dokončila s 2 -ným roztokom chlómanu sodného a trojnásobným premytím explantu v sterilnej vode. Výsledné explanty sa preniesli do Petriho misky v médiu podľa Murashigeho a Skooga, obsahujúcom 3 sacharózy s prídavkom Lynsmeyerových a Skoogových vitamínov a honnónov, ako je ZA-dichlórfenoxyoctová kyselina a nattyloctová kyselina. Produkty sa inkubovali v tme pri 23 °C počas 20 dní. Na konci tohto obdobia sa získali drobive kalusy,ktoré ľahko rástli a boli prenesené v plynulých radoch subkultiváciami pri rovnakých podmienkach, až sa mohli použiť na propagáciu v kvapalnom médiu. Tieto kalusy sa použili na zaočkovanie do Erlenmayerových baniek, obsahujúcich 200 ml média podľa Murashigeho a Skooga s prídavkom kyseliny naťtyloctovej a G-(Lr-dimetylamino)-purinu,Lynsmeyerových a Skoogových vitamínov a 3 sacharózy ako zdroja uhlíka. Banky sa inkubovali za miešania pri neprenžitom osvetlení 4 dni, potom sa bunková biohmota oddelila na extrakciu glykoproteínov.5 litrov kultúry ziskanej podľa prlkladu l sa odstredilo pri nízkych otáčkach a získané bunky (1,5 kg čerstvej hmotnosti) sa extrahovali 1,5 litrom 70 Vo-ného etanolu,obsahujúceho 1 kyseliny sírovej. Na kvantitativne získanie zasaditých glykoproteínov sa extrakcia dvakrát opakovala . Po neutralizácii sa extrakty filtrovali na úplné odstránenie zákalu a skoncentrovali sa vo vákuu pri 50 °C až do úplného odstránenia etanolu. Vodný koncentrát sa zahrieval pri 85 °C počas 30 minút a na odstránenie zákalu sa znova odstredil zákal sa vyhodil. Výsledný číry roztok sa podro bil ultrañltrácii použitím membrány CentroconR s hranou delenia 40 000 D na vylúčenie vyšších molekulových hmotnosti.Filtrovaný produkt sa potom znova podrobil ultrañltrácii s použitím membrány s dutými vláknami s hranou delenia 10 000 D na odstránenie neglykoproteínových látok,látok s nízkou molekulovou hmotnosťou. Filtrát sa potom podrobil dialýze a skoncentroval sa tak, aby obsahoval 1 tuhého zvyšku. Získalo sa 1,5 litra mieme viskózneho produktu, ktorý sa môže do kozmetických formulácii použiť samotný. Pri elektroforetickej analýze produkt mal 6 pásov,z ktorých 4 mali molekulové hmotnosti 16 000, 22 000, SK 280572 B 6Spôsobom uvedeným v príklade l sa pripravila bunková hmota zo sterilných klíčkov Lycapersicum esculentum. Príprava sa vykonala V l 4-litrov 0 m fermentačnom zariadení, v ktorom bolo 10 litrov média podľa Murashigeho a Skooga s prídavkom kyseliny naftyloctovej a ó-(m-dimetylamino)-purínu, Lynsmeyerových a Skoogových vitamínov a 3 °/u sacharózy ako zdroja uhlíka. Fermentácia sa vykonala pri 23 C počas 5 dní za miešania (150 otáčok za minútu) za prítomnosti kvasinkovćho extraktu v koncentrácii 0,05 a s približne 70 Vo-nou koncentráciou rozpusteného kyslíka. Po ukončení fermentácie sa na skoncentrovanie buniek oddelila kultúra a mikrotiltrovala keramickou membránou (0,2 m). Do získanej bunkovej pasty sa pridalo niečo izopropanolu, obsahujúceho 0,5 kyseliny chlorovodíkovej, a pokračovalo sa extrakčným spôsobom,uvedeným v príklade 2. Ziskalo sa 3,5 litra roztoku s obsahom 0,5 sušiny. Analýza lyoñlizovaných roztokov mala obsah 10 prolínu a 31 hydroxyprolínu.Roztok z príkladu 2 alebo 3 10,0 g Acetylovaný lanolínový alkohol PEG-O 2,0 g Cetyl-stearyl alkohol 1,5 g Palmítan cetylalkoholu 2,0 g Kyselina stearová 7,0 g Oktyl oktanoát 7,5 g Cetylfosforečnan draselný 0,5 g Konzervačne látky podľa potreby Vonné látky podľa potreby Čistená voda do 100 g Príklad 5Roztok z príkladu 2 alebo 3 10,0 g Cetyl stearyl glukozid 5,0 g Jojobový olej 10,0 g Izopropylmyristát 8,0 g Dimetícon 0,5 g Antioxidant podľa potreby Vonné látky podľa potreby Čistená voda do 100 g1. Glykoproteiny bohaté na hydroxyprolin (HPRGS),ziskateľné extrakciou alkoholom z kyslćho prostredia z Gingko biloba, Lycopersicum esculentum, alebo z ich bunkových kultúr spôsobom, ktorý zahŕňaa) kultivácíu Gingko biloba, Lycapersicum esculentum buniek v tekutom prostredí počas 3 až 12 dníb) extrakciu bunkovej hmoty vodou míešateľnými alkoholmi za prítomnosti zriedených minerálnych kyselínc) neutralizáciu, skoncentrovanie a zahrievanie extraktov pri teplotách medzi 70 °C a 100 °Cd) odstredenie s oddelením usadeniny, frakčnú ultrañltráciu a dialýzu supematanta, uvedené HPRGs majú priemernú molekulovú hmotnosť 20 000 daltonov s intervalom hodnôt od 12 000 do 38 000 daltonov, ktora bola určovaná gćlovou permeáciou a elektroforézou.2. Kozmetické a farmaceutické prostriedky, v y Zľsžłčlłjúťć sa tým, že obsahujú ako účinnú zlc žku glykoproteíny podľa nároku l, ktorá má. hydratačnć,filmotvomé, tonizujúce a hojivé vlastnosti.3. Prostriedky podľa nároku 2, v y z n a č u j ú c e s a t ý m , že sú vo forme vodných sprejov, vôd, roztoko x, emulzií, gélov, mastí, krěmov a liečivých gáz.

MPK / Značky

MPK: C07K 14/415, C12P 21/00, A61K 38/16, A61K 7/48

Značky: farmaceutické, bohaté, glykoproteíny, prostriedky, hydroxyprolín, kozmetické, obsahom

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-280572-glykoproteiny-bohate-na-hydroxyprolin-kozmeticke-a-farmaceuticke-prostriedky-s-ich-obsahom.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Glykoproteíny bohaté na hydroxyprolín, kozmetické a farmaceutické prostriedky s ich obsahom</a>

Podobne patenty