Spôsob fermentačnej výroby aminokyselín

Číslo patentu: 279888

Dátum: 10.01.1996

Autori: Degener Wolfgang, Friedrich Heinz, Pfefferle Walter, Lotter Hermann

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Spôsob fermentačnej výroby aminokyselín, pri ktorom sa kultivuje kmeň rodu Brevibacterium alebo Corynebacterium produkujúci jednu alebo viacero aminokyselín v živnom prostredí a na konci fermentácie sa z kultivačnej kvapaliny izoluje aminokyselina alebo aminokyseliny. Bakteriálna kultúra má po fáze silného rastu dispozícii menej využiteľného zdroja uhlíka na to, aby mohla v dôsledku konštrukcie kmeňa a množstva iných potrebných doplnkových prísad, ktoré sú prítomné v živnom prostredí, metabolizovať.

Text

Pozerať všetko

I (1 l) Číslo dokumentu SLOVENSKA REPUBLIKA I 9, SK 279 888 Číslo prihlášky 2633-92 Dátumpodanía 26.08.92 m) D (mkmenm B Čislo piioritnej prihlášky r 41 30 867.0 (51) Im C 15 Dátum priority 17.09.91 C 12 P 13/04 C 12 P 13/08// Krajina priority DE (C 12 P 13/04, ł C 12 R 113) URAD V Datum zverejnenia 10.01.96 (C 12 P 13/04 PRIEMYSELNEHO C 12 R 1 1 5 VLASTNÍCTVA Dátum zverejnenia udelenia vo Vestníku 07.05.99 ) SLOVENSKEJ REPUBLIKY V Cislo PCT(73) Majiteľ patentu Degussa Aktiengesellschait, Frankfurt am Main, DE(72) Pôvodca vynálezu Pfefferle Walter, Dr., Dipl.-Biol., Halle, DE Lolter Hermann, Dr., Dipl-Chem, Hainburg, DE Friedrich Heinz, Dr., DípL-Chern, Hanau, DE Degener Wolfgang, Dr., DipL-Chem, Bielefeld, DE(54) Námv vynálezu Spôsob fermentačnej výroby aminokyselínSpôsob fermentačnej výroby aminokyselín, pri ktorom sa kultivuje kmeň rodu Brevibacterium alebo Carynebacterium produkujúci jednu alebo viacero aminokyselín v živnom prostredi a na konci fermentácie sa z kultivačnej kvapaliny izoluje aminokyselina alebo aminokyseliny. Bakteriálna kultúra má po fáze silného rastu k dispozícii menej využiteľný zdroj uhlíka na to, aby mohla v dôsledku konštrukcie kmeňa a množstva mých potrebných doplnkových prisad, ktoré sú prítomné V živnom prostredí, metabolizovať.Vynález sa týka spôsobu fermentačnej výroby arninokyselín, ako je napríklad L-lyzín alebo L-treonín. L-lyzín je esenciálna aminokyselina a vo veľkom rozsahu sa používa ako prísada do krmív.Rad aminokyselín sa obyčajne Vyrába bíosyntetickýrn postupom, ktorý je dlhý čas známy z doterajšieho stavu techniky. Bakteriálne kmene používané ako produkčná mikroorganizmy sa vyznačujú schopnosťou vylučovať tieto aminokyseliny V lcrátlçom čase a Vo vysokej koncentrácii do kultivačného média. Aby nebolo nutné používať vysokú počiatočnú koncentráciu substrátu, používa sa spravidla postup Fed-Batch (dávkovanie vsádzky).Vďaka veľmi vysokej kapacite látkovej výmeny použitých produkčných kmeňov má rozhodujúci význam viesť fermentačný proces tak, aby maximálna hodnota spotreby kyslíka a vývoja tepla mala rádovo velkosť, ktorá je hospodáma. Boli preto používané rôzne stratégie umožňujúce riadiť metabolickú aktivitu mikroorganizmov tak, aby bolo možne zaistiť na jednej strane zásobovanie kyslíkom a odVádzanie tepla a na druhej strane, aby bolo vyvážené rozdelenie tvorby a biomasy produktu.Z CS patentového spisu č. 212 558 je známy spôsob diskontínuálneho prikrmovania, pri ktorom sa rnetabolická aktivita V rastovej fáze nastavuje zmenami pH a celkový obsah biomasy reguláciou alfa-amínodusíka.V SU patentovom spise č. l 157 059 je opísaný spôsob diskontinuálneho prikrmovania, pri ktorom slúži koncentrácia treonínu ako kritérium pre prikrmovanie a pri ktorom sa obsah redukujúcej zlúčeniny udržuje na 3 až 5 .Veľmi dobre vyladený postup je známy z FR patentoVého spisu č. 8 303 487, Pri tomto postupu sa používajú dva kontinuální pridávame násadové roztoky roztok leucín/fostät, ktorý sa dávkuje tak, že sa dodávkou prísady obmedzuje nielen intenzita látkovej výmeny, ale tiež tvorba biomasy a roztoku cukru, ktorý sa dávkuje tak, aby sa okamžitá koncentrácia cukru udržovala na hodnote V rozmedzí od 5 do 15 g/l. Z toho je zrejmé, že v dôsledku obmedzenia prísadou leucín/foslät V priebehu fázy prikrmovanía sa V každom okamihu spotrebuje menej cukru, než je V kultivačnom médiu k dispozícii. Tento Výrobný postup je V súlade s niekoľkokrát dokumentovaným názorom, že je treba sa vyhnúť tak obmedzeniu uhlíka ako silnemu prebytku uhlíka (napríklad DD patentový spis 269 167).Hadj Sassi a ďalšie, Biotechn. Letters, zv. 10, č. 8, str. 583 až 586 (1988) na to navrhujú dokonca použitie glukózy V koncentrácii 90 až 140 g/l. Metabolická aktivita sa teda Vždy reguluje hodnotou inej veličiny, ako je zdroj uhlíka.Úlohou Vynálezu je vyvinúť spôsob fennentačnej výroby aminokyselín, ktorý by prebiehal s vyšším stupňom konverzie nasadzovaného zdroja uhlíka (cukru) a pri ktorom by sa dosahovala V suchej hmote, zbavenej biomasy,vyššia koncentrácia aminokyselín.Predmetom vynálezu je spôsob fermentačnej výroby aminokyselín, pri ktorom sa kultivuje kmeň rodu Brevibacterium alebo Corymzbacterium, produkujúci jednu alebo viac aminokyselín, V živnom prostredí a na konci fermentácie sa z kultivačnej kvapaliny ízoluje aminokyselín alebo aminokyseliny, ktorého podstata spočíva V tom, že bakteriálna kultúra má V nadväznosti na fáze silného rastu,t. j. V produkčnej táze, k dispozícii menej využiteľný zdroj uhlíka, ako by mohla V dôsledku konštrukcie kmeňa a množstva inak potrebných prisad, prítomných V živnom prostredí, metabolizovať.Ferrnentačné (živne) medium má inak všeobecne známe zloženie. Popri zdroji uhlíka, ako sú asímilovateľné cukry, sacharóza, glukóza, melasa alebo škrobové hydrolyzáty a amónne ióny obsahuje pri auxotrofných producentoch komplexné zložky, ako zdroj organických prisad, ktoré sú potrebne v dôsledku jednej alebo viacerých auxotrotií. Týmito zložkami sú napríklad proteínové hydrolyzáty, ako Zdroj altä-aminokysehh, vitamíny a anorganické soli. Pri silnom raste na počiatku ferrnentácie dochádza spravidla k logaritmickému rastu. Logaritmickú rastovú fázu je možne podľa potreby skrátiť obmedzením prisad a/alebo zdroja uhlíka.Aj V nadväznosti na túto fázu dochádza k rastu buniek. Jeho rozsah robí však len nepatmý zlomok rastu prebiehajúceho vo fáze, ktorá je označovaná tennínom fáza rýchleho rastu.Prednostne sa používajú kmene, ktoré produkujú L-lyzín a/alebo L-treonín.Fermentačne prostredie sa volí tak, aby teplota ležala V rozmedzí od 25 do 40 °C, prednostne od 30 do 36 °C, hodnota pH V rozmedzí od 6 do 8, prednostne od 7 do 7,5 a koncentrácia amónnych iónov V rozmedzí od 0,5 do 8 g/1. Suspenzia sa mieša a dostatočne zásobuje kyslíkom. Najmä pri producentoch lyzinu auxotrofných proti aminokyselinám je možne metabolizácíu cukru riadiť množstvom prídávanej aminokyseliny. Jej koncentrácie, prípadne koncentrácie iných potrebných prisad je po rastovej taze výhodne v rozmedzí od 0 do 0,1 g/1,od 0 do 0,05 g/l, Tak napriklad pri produkčnom nukroorganízme produkujúceho lyzín, ktorý je auxotrotioý proti leucínu sa volí pomer cukru k leucínu V kontinuálne pridávanom prikrmovacom médiu tak, aby sa tvorba biomasy lirnitovala zásobovaním leucínom, ale zároveň sa dodáva len zlomok cukru, ktorý by mohol byť pri danej koncentrácii leucínu konvergovaný.Koncentrácia využiteľných cukrov po fáze silného rast 11 robí výhodne 0 až menej ako 3 g/l, osobitne však 0 až 1 g/l.Koncentrácia O g/l vo lermentačnom médiu neznamená však ani vo vzťahu k pripadne potrebným doplnkovým prisadám, ani vo vzťahu k zdroju uhlíka, že by sa tieto látky kontínuálne neprivádzali. Znamená to skôr, že sa tieto zlúčeniny privádzajú v množstvách, ktoré sú bakteriálnymi kultúrami bezprostredne spotrebované.Fennentačný postup podľa vynálezu má rad rozhodujú cich výhod oproti bežným postupom, ktoré boli uvedené l. Metabolická aktivita a tým aj potreba kyslíka a vývoj tepla V kultúre môžu byť ovplyvňované priamo a bez prieťáhov rýchlosťou dávkovania prikrmovacíeho média a môžu byt prispôsobené kapacite fermentora.2. Fennentačná suspenzia obsahuje väčšie množstvo produktu V celkovej sušine a má teda vyššiu čistotu. Tým, že bakterialna kultúra má po celý časový úsek, v ktorom sa uskutočňuje priktmovanie k dispozícii menej substrátu, ako by mohla konvergovať, dochádza k tomu, že zdroj uhlíka predstavuje hlavne obmedzenie. Tým sa zabraňuje konverzii na vedľajšie produkty.3. Oproti priebehu fermentácie, pri ktorej sa hlavné obmedzovanie uskutočňuje prostredníctvom doplnkových prisad,ma ferrnentacia podľa vynálezu vyššie výťažky.4. Pri monitorovaní produktu sa môže fermentácia priamo a bez dobehu prerušiť v optimálnej fáze, tzn. v oblasti plató hrubý výťažok pritom v každom časovom okamihu zodpovedá čistému výťažku.5. Pri spracovaní ferrnentačného produktu, ldoré sa vykonáva priamym odparením vzniknutej suspenzie, sa môže pri technických poruchách obsah fermentora priamo viest na spracovanie, bez toho, aby došlo k zhoršeniu kvality produktu vysokým zvyškovým obsahom cukru.Vynález je bližšie objasnený V nasledujúcich príkladoch rozpracovania. Tieto príklady majú výhradne ilustratívny charakter a V žiadnom ohľade neobmedzujú rozsah vynálezu.Do feimentačnej nádoby, ktorá je opatrená rniešadlom a prevzdušňovacím systémom sa predloží 5,1 kg sterilného roztoku obsahujúceho nasledujúce zložkyhydrolyzovaný kukuričný lepok 35 g(pomocou kyseliny sírovej) hydrolyzát produkovanej biomasy 320 gďalšie minerálne soli, stopové látky, ako tiež biotín a tiamin.Hodnota pH zmesi sa prídavkom roztoku arnoniaku nastaví na 7,3. K vzniknutemu roztoku sa pri teplote 33 až 35 °C pridá 0,6 l očkovacej kultúry Corynebacterium glutamicum DM 346-1, ktorá nesie genetický markér leu, ktorý j e oxalyzin-rezistentný a aminoetyl-rezistentný. Očkovacia kultúra sa pripraví 15 hodinovou inkubáciou pri 33 °C a pH 7 za miešania a prevzdušňovania V médiu obsahujúcom 4,4 hmotnostného melasy, pridavne 2 sachaíťizy a ďalej 14 hydrolyzovanej sójovej múky (pomocou kyseliny sírovej), za prísady 3 síranu amónneho, 0,05 kyseliny fosforečnej a 0,02 síranu horečnatého, ako tiež vitamínov biotínu a tiamínu.Po skončení logaritmickej rastovej fázy V hlavnom fermentore sa za dostatočného miešania, prevzdušňovania a upravovania hodnoty pH na približne 7,3 pomocou vodného roztoku amoniaku obvyklým spôsobom počas 32 hodin kontinuálne pridáva nasledujúce médium, ktoré je neutralizované vodným roztokom amoniaku tak, aby merateľná koncentrácia cukru vo ferrnentačnej suspenzii ležala v roz medzí od 5 do 35 g/l (podľa enzymatického stanovenia na sacharózu a glukózu)voda 1250 g melasa 94 g glukóza 1465 g hydmlyzovaný kukuričný lepok 39 g(pomocou kyseliny sírovej) hydrolyzát produkovanej biomasy 265 gďalšie minerálne soli, stopové látky, ako tiež biotin a tiamin.Na konci femuentácie, po spotrebovani celého množstva asimilovateľného cukru vo ferrnentačnom médiu robi stupeň konverzie cukru na lyzín približne 35 , rátané ako hydrochlorid lyzínu. Obsah lyzínovej bázy v odparenom fennentačnom roztoku, zbavenom biomasy, je približne 45 .Príprava inokula, zloženie média V hlavnom fermentore a kultivačne podmienky sú rovnake ako V príklade l. Tiež médium 2 je tvorené rovnakými zložkami, s výnimkou nasledujúcich modiñkácií voda 1560 g melasa 75 g glukóza 1170 gPri tomto pokuse sa príkrmovacie médium dávkuje romakou rýchlosťou ako v príklade 1. Priebežné analýzy na asimilovateľný cukor ukazujú, že je v súlade so znakmi tohto vynálezu po celý čas prikrmovania udržovaná merateľna koncentrácia asimilovateľných cukrov nižšia ako 3 g/l, dokonca takmer výlučne nižšia ako 1 g/l. Analýzy na leucín vo ferrnentačnej suspenzii, ktoré sa uskutočňujú pomocou analyzátora aminokyselín, ukazujú, že v priebehu prikrmovania nie je po spotrebovani leucínu, ktorý bol predložený v médiu 1, v žiadnom okamihu koncentrácia leucínu vyššia ako 0,05 g/ 1.Na konci fermentácie robí stupeň konverzie cukru na lyzín (rátané ako hydrochlorid lyzínu) 40 . Obsah lyzínovej bázy v odparenorn fermentačnom roztoku, ktorý bol zbavený biomasy, je približne 54 .Príklad 3 Do reaktora s objemom 10 m 3 sa predloží 3 980 kg sterilného média, ktoré má nasledujúce zloženiesacharóza 320 kg rrielasa 20 kg hydrolyzovaný kukuričný škrob 230 kg 25 vodný síran amónny 150 kg monohydrát kyseliny citrónovej 2,3 kg kyselina fosforečná 89 6,6 kg síran horečnatý - heptahydrát 2,8 kg chlorid vápenatý - dihydrát 75 g síran železnatý - monohydrát 1 13 g síran mangánatý - monohydrát 113 g síran zinočnatý - heptahydrát 5,6 g síran meďnatý - pentahydnát 0,6 g biotin 1,1 g tiamínhydrochlorid 0,8 g hydroxid amónny (2 až 3 ) 1010 kgObsah reaktor-a sa mieša pri 33 °C a dostatočne prevzdušňuje. Po pridaní 250 1 inokula kmeňa DM 282-2, ktorý nesie leucín-auxotrofríý a aminoetylcysteín-rezistentný geneticky marker (po 16 hodinách inkubácie v médiu sa 6 melasy, 14 hydrolyzátu sójovej múky, l /o síranu amónneho a 0,1 kyseliny fostbrečnej, pri pH 7 a 30 °C) do reaktora s objemom 10 m 3 sa hodnota pH udržuje pridávaním vodného amoniaku na 7,0 a prevzdušňovanie sa nastaví tak, aby obsah rozpusteného kyslíka bol vždy vyšší ako zodpovedá 15 nasýteniu.Keď kultúra narastie na optickú hustotu (pri 535 nm) približne 30, pridáva sa produkčná médium nasledujúceho zloženia rýchlosťou 30 l/hsacharóza 940 kg melasa 50 kg hydrolyzovaný kukuričný lepok 180 kg 25 vodný síran amónny 80 kg kyselina citrónová - monohydrát l kg kyselina tbsforečna 89 2,8 kg síran horečnatý - heptahydrát 1,2 kg síran železnatý - monohydrát 48 g siran mangánatý - monohydrál 48 g síran zinočnatý - heptahydrát 2,4 g síran meďnatý - pentahydrát 0,3 g biotín 0,6 g tiamínhydrochlorid 0,4 g hydroxid amónny 25 80 kg voda 740 kg pH 7,5.V priebehu produkčnej fázy sa hodnota pH udržuje na 7,3. Po spotrebovaní cukru predloženého do rastového media sa v súladu s charakteristikou tohto vynálezu v priebehu fázy prikrmovania udržuje koncentrácia asimilovateľneho cukru na hodnote nižšej ako 1 g/1, pričom merateľna koncentrácia leucínu je nižšia ako 0,05 g/l.Po skončení termentacie je stupeň konverzie cukru na lyzin (r-átane ako hydrochlorid lyzínu) približne 32,3 . Obsah lyzínovej bázy v odparenom fennentačnom roztoku,ktorý sa získa oddelením biomasy, je 54,7 .Výroba inokula, parametre postupu a médiá použité v rastovej fáze a v produkčnej fáze sú rovnaké ako v príklade 3. Rýchlosť dàvkovania vo fáze prikrmovanie je približne 100 l/h. Tým sa dosiahne, že po spotrebovaní cukru, pritomného V predloženom rastovom médiu je merateľná koncentrácia asimilovateľného cukru v priebehu času prikrmovania vždy výrazne nižšia ako 5 g/l. Merateľná koncentrácia leucínu však zostáva na hodnote nižšej ako 0,05 g/l. Stupeň konverzie cukru na lyzín (vztiahnuté na hydrochlorid lyzínu je na konci fermentácie približne 30,9 ). Obsah lyzínovej bázy V roztoku získanorn po oddelení biomasy je uMédiá na výrobu inokula pre rastovú täzu a pre pmdukčnú fázu majú rovnaké zloženie ako médiá použité V príklade l, s tým rozdielom, že sa glukóza nahradí v rastovom médiu sanharózou v množstve 25 g/ l a v produkčnom médiu sacharózou v množstve 564 g/ l. Podmienky inkubácie, vrátane prípravy inokula, sú tiež rovnaké. V malomfemientore s rniešadlorn a zavzdušňovaním sa predloží 0,82 kg (0,8 l) sterilného rastového média.K tomuto roztoku sa pri teplote 33 až 35 °C pridá 0,1 1 očkovacej kultúry Carynebacteríum glutamicum DSM 5715. Po dosiahnutí optickej hustoty približne 30 (535 nm) sa v priebehu 24 hodín kontinuálne pridáva produkčne medium (celkom 533 g, tzn. 430 ml).Počas fázy priknnovanía leží merateľný obsah cukru vo fermentačnom médiu vždy pod 5 g/l a obsah leucínu je po spotrebovaní leucínu predloženého v rastovom prostredí vždy nižší ako 0,05 g/l.Na konci fermentácie sa v médiu stanovila 74 g lyzínu(vyjadrené ako hydrochlorid lyzínu), čo pri celkovej násade sacharózy 275 g zodpovedá stupňu konverzie 27 . Obsah lyzínu V celkovej sušine je približne 30,5 .Opakuje sa pokus s kmeňom DSM 5715, pričom všetky médiá a všetky parametre inkubácie sú zhodné s podmienkami uvedenými v príklade S. Produkčná médium sa v tomto prípade kontinuálne dávkuje počas 39 hodín.V súlade s charakteristikou tohto vynálezu je v priebehu času prikrmovanía, po spotrebovaní zdroja uhlíka a zdroja leucínu, ktoré boli predložené v rastovom prostredí, okamžitá koncentrácia sacharózy vždy nižšia ako l g/l a okamžitá koncentrácia leucínu vždy nižšia ako 0,05 gr. Na konci fermentácie je v médiu obsiahnutých 89 g lyzínu (vyjadrené ako hydrochlorid lyzínu), čo zodpovedá stupňu konverzie 32 . Obsah lyzínovej bázy v celkovej siršíne je 36,3 .l. Spôsob ferrnentačnej výroby aminokyselín, pri ktorom sa kultívuje kmeň rodu Brevibacterium alebo Corynebacterium, produkujúci jednu alebo viac aminokyselín v živnom prostredí a na konci fennentácie sa z kultivačnej kvapaliny izoluje aminokyselina alebo aminokyseliny,vyznačujúci sa tým, že bakteriálna kultúra má po fáze silného rastu k dispozícii menej využiteľný zdroj uhlíka na to, aby mohla v dôsledku konštrukcie kmeňa a množstiev iných potrebných dophrkových prísad,ktoré sú prítomné v živnom prostredí, metabolizovať.2. Spôsobpodľanároku Lvyznačujúci s a t ý m , že po fáze silného rastu je koncentrácia zdroja uhlíka V rozrnedn od 0 do menej ako 3 g/l.3. Spôsob podľa nároku l alebo 2, V y z n a č u j ú c i s a t ý m ,že sa používajú auxotrofné kmene baktérií a koncentrácia aspoň jednej organickej látky, ktorá sa pridáva V dôsledku prípadne víacnásobnej auxotroñe kmeňa, sa po fáze silného rastu udržuje na hodnote obmedzenej na rozmedzí 0 až 0,1 g/ l.4. Spôsob podľa niektorého z nárokov l až 3, v y značujúcí sa tým,žesapoužívakmeň produkujúci L-lyzaĺu a/alebo L-treonín.5, Spôsobpodľanároku Lvyznačujúci s a t ý m , že sa používa leucín-auxotrofný kmeň C 0 rynebaclerium glutamícum.

MPK / Značky

MPK: C12P 13/08, C12P 13/04

Značky: výroby, aminokyselin, fermentačnej, spôsob

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-279888-sposob-fermentacnej-vyroby-aminokyselin.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob fermentačnej výroby aminokyselín</a>

Podobne patenty