Mikrobiologický spôsob hydroxylácie dusíkatých heterocyklických karboxylových kyselín, mikroorganizmy Ki101 DSM 6920 a dusíkaté hydroxyheterocyklické karboxylové kyseliny

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Vynález sa týka nového mikrobiologického spôsobu prípravy dusíkatých hydroxyheterocyklických karboxylových kyselín alebo ich rozpustných solí všeobecného vzorca (I). Východiskovou látkou sú dusíkaté heterocyklické karboxylové kyseliny. Vynález sa ďalej týka nových, na spôsob prípravy vhodných mikroorganizmov.

Text

Pozerať všetko

Číslo prioritnej prihlášky 672/92 (51) 1 C 1 6 Dátum priority 04.03.92 C 121 17/12 C 07 D 21 3/ 80 Krajina priority CH C 07 D 241/24 C 12 N 1/20// ÚRAD Datum ZVEIEJHBHIB. 06.10.93 (C IZN 1/20 PRJEMYSELNÉHO C HR 1 01 VLASTNÍCTVA Dátum zverejnenia udelenia vo Vestníku 07.10.98 - ) SLOVENSKEJ REPUBLIKY(73) Majiteľ patentu LONZA A. G. (Dir. Basel), Gampel/Wallis, CH(72) Pôvodca vynálezu Kiener Andreas, Dr., Visp/Kanton Wallis/, CH Tschech Andreas, Dr., Aarau, CH Tinschert Andreas, Dipl. biológ, Brig, CH Heinzmann Klaus, Vispertenninen/Wallis, CH(54) Názov vynálezu Mikrobiologický spôsob hydroxylácie duslkatých heterocyklických karboxylových kyselín, mikroorganizmy Ki 101 DSM 6920 a dusíkaté hydroxyheterocyklické karboxylové kyseliny(57) Anotácia Vynález sa týka nového mikrobiologického spôsobu n x cm prípravy dusíkatých hydroxyheterocyklíckých karbo- 1 xylových kyselín alebo ich rozpusmých solí všeobec-(I) ného vzorca (I). Východiskovou látkou sú dusíkaté R 2 N OHhetcrocyklickć karboxylové kyseliny. Vynález sa ďalej týka nových, na spôsob prípravy vhodných mikroorganizmov.Vynález sa týka nového mikrobiologického spôsobu prípravy dusíkatých hydroxyheterocyklických karboxylových kyselín alebo ich rozpustných solí všeobecného vzor ca (I) n x comu u i n n oupri ktorom sa vychádza z zodpovedajúcich dusikatých heterocyklických karboxylových kyselín. Vynález sa týka aj nových mikroorganízmov vhodných na spôsob prípravy.V nasledujúcom texte sa ako dusíkaté heterocyklické karboxylovć kyseliny, hydroxylované alebo nehydroxylovane, chápu tiež ich rozpustně soli, ako napríklad ich alkalické soli alebo amónne soli.Dusíkaté Z-hydroxyheterocyklické karboxylovć kyseliny sú dôležitými medziproduktmi pri syntézach účinných látok. Napríklad kyseliny Z-hydroxynikotínová sa používa ako východisková látka na prípravu kyseliny 2-chlómíkotinovej (US patentový spis 4 081 45 l), ktorá je napríklad dôležitým medziproduktom na výrobu famiaceutických prostriedkov (Ann. Pharrn. Fr., 1980, 38 (3), str., 243-252).Dosiaľ nie sú zname žiadne mikrobiologickć spôsoby prípravy dusíkatých hydroxyheterocyklických karboxylových kyselín.Úlohou vynálezu je poskytnúť jednoduchý a ekologický mikrobiologický spôsob prípravy chemicky ťažko dostupných dusíkatých 2-hydroxyheterocyklických karboxylových kyselín.Túto úlohu vyriešil spôsob prípravy podľa vynálezu uvedený v patentovom nároku l a nové mikroorganizmy podľa patentového nároku 6.Spôsob podľa vynálezu spočíva v tom, že sa dusikatá heterocyklická karboxylová kyselina všeobecného vzorcakde R 1 a R 2 sú rovnaké alebo rozdielne a znamenajú atóm vodíka, atóm halogénu alebo C 1-C 4-a 1 ky 1 ovú skupinu a X znamená atóm dusíka alebo skupinu CR 3, v ktorej R 3 znamená atóm vodíka alebo atóm halogénu, ako substrát,prevedie pomocou mikroorganizmov, ktoré zužitkujú kyselinu 6-metylnikotínovú a ktoré obsahujú špecifickú hydroxylázu, na dusikatá hydroxyheterocyklickú karboxylovú kyselinu všeobecného vzorca (l)Pod pojmom mikroorganizmy zužitkujúce kyselinu 6-metylnikotínovú, ktoré obsahujú špecifickú hydroxylázu sa rozumie nasledujúceAk sa napríklad pestuje biomasa z kalu čistiacich zariadení ako inokulum s kyselinou 6-metylnikotínovou, získajú sa mikroorganizmy zužitkujúce kyselinu 6-metylnikotínovú, t. j. mikroorganizmy, ktoré rastú s kyselinou ő-metylnikotínovou ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energíc. Ak sa metódami bežnými v odbore podrobia selekcii mikroorganizmy, ktoré úplne odbúravajú kyselinu 6-metylnikotínovú cez kyselinu 6-hydroxy-ó-metylnikotínovú ako medziprodukt, získajú sa mikroorganizmy, ktoré obsahujú špecifickú hydroxylázu. To znamená, že sa získajú mikroorganizmy, ktoré špecificky hydroxylujú jediný atóm uhlíka, ktorý leží medzi kyselinovou funkciou a atómom dusíka.Na spôsob podľa vynálezu sú vhodné v podstate všetky mikroorganizmy, ktoré sa týmto spôsobom podrobili selekcii, napríklad z kalov čistiacich zariadeni alebo vzoriek pôdy. Tieto mikroorganizmy nie sú v literatúre opísané a sú súčasťou vynálezu.Výhodne sa pri spôsobe podľa vynálezu používajú mikroorganizmy s označením Kil 0 l (DSM 6920), rovnako ako aj ich descendenty a mutanty. Mikroorganizmy boli uložené 10. O 2. 1992 v Nemeckej zbierke pre mikroorganizmy a bunkové kultúry GmbH, Mascheroderweg lb,D-3300 Braunschweíg.Vedecký opis mikroorganizmov Ki 101 (DSM 6920) bunková forma drobné tyčinky šírka m 0,4 - 0,5 dĺžkav m 1,0 - 1,5 pohyblivosť kmitanie Gram-reakcia lýza 6-ným KOH aminopeptidáza (Cerny) spóry oxidáza katalázaRod cez l 6 S rRNA-sekvenčnú analýzu sa nedal určiť.Selekcia a pestovanie týchto míkroorganizmov s kyselinou ó-metylnikotínovou sa uskutočňuje metódami bežnými v odbore.Počas selekcie sa účelne uskutoční scrcening mikroorganizmov za aeróbnych podmienok. Výhodne sa mikroorganizmy počas sreeningu pestujú v pokoji (nie za trepania).Množstvo kyseliny ó-metylníkotínovej je počas selekcie a pestovania účelne až do l hmotn., výhodne do 0,5 hmotn.Selekcia a pestovanie sa účelne uskutočňujú pri hodnote pH od 5 do 9, výhodne od 6 do 8.Teplota počas selekcie a pestovania môže byť medzi 15 až 50 °C, výhodne medzi 25 až 40 °C.Zvyčajne sa Selekcia a pestovanie uskutočnia v médiu obsahujúcom minerálne soli, výhodne v médiu s obsahom minerálnych solí, ktorého zloženie je uvedené V tabuľke 1.Ked sa dosiahne vhodná optická hustota pri 650 nm(0 D 550) od 0,5 do 100, môžu sa mikroorganizmy zbierať bud metódami bežnými v odbore, alebo sa môže subsrát,dusikatá heterocyklická kyselina, pridať priamo k mikroorganizmom na vlastnú reakciu (biotransformáciu). Vlastná biotransforrnácia sa potom uskutoční s nerastúcimi bunkami metódami v odbore bežnými.Ako substráty všeobecného vzorca (11) môžu sa použiť napríklad kyselina nikotínová, kyselina pyrazínkarboxylová alebo ich halogénderiváty alebo Cj-C 4 alkylderiváty.Ako halogénderiváty kyseliny nikotínovej alebo kyseliny pyrazínkarboxylovej sa výhodne hydroxylujú kyselina ó-chlómikotínová, kyselina iő-dichlómikotínová a kyselina S-chlórpyrazínkarboxylová.Ako derivát kyselina C 1-Crg-alkylpyrazinkarboxylovej sa výhodne hydroxyluje kyselina S-metylpyrazinkarboxylovà.Substrát sa na biotransformáciu môže pridávať kontinuálne alebo jednorázovo. Výhodne sa substrát pridáva tak,aby koncentrácia substrátu V kultivačnom médiu neprekročila 10 hmotn., výhodne 7 hmotn.Ako médium sa môžu použiť na biotransformáciu média bežne V odbore. Výhodne sa biotransforrnácia uskutočňuje v nizkomolárnom fosfátovom pufri.Zvyčajne sa biotransformácia vykonáva so suspenziou mikroorganizmov, ktorá má optickú hustotu od 0,5 do 100 pri 650 nm (OD 550), výhodne od 5 do 50.Biotransforrnacia sa účelne vykonáva pri teplote od 15 do 50 °C, výhodne od 25 do 35 °C a pri hodnote pH od 5 do 9, výhodne od pH 6,5 do 7,5. Po obvyklom reakčnom čase od 5 hod. do 3 dní sa môže hydroxylovaný produkt všeobecného vzorca (1) ízolovať v odbore bežnými metódami, napr. okyslením bezbunkového supematantu.Dusíkaté hydroxyheterocyklicke karboxylove kyseliny pripravené týmto spôsobom všeobecného vzorca (I)v ktorom ak X znamená atóm dusíka, R 1 a R 2 sú zhodné alebo rozdielne a znamenajú atóm vodíka, atóm halogénu alebo C 1-C 4-alkylovú skupinu s výnimkou, že R 1 a R 2 nie sú súčasne atómom vodíka, rovnako ako keď X znamená CH-funkciu, R 1 a R 2 znamenajú atóm halogěnu, nie sú V literatúre opísané.Najvýhodnejšími z týchto nových zlúčenín sú kyselina 5,6-dichlór-Z-hydroxynikotínová, kyselina 3-hydroxy-5-methylpyrazínkarboxylová a kyselina 3-hydroxy-5-chlórpyrazínkarboxylová.Príklad 1 Izolácia mikroorganizmov zužitkujúcich kyselinu 6-metylnikotínovú300 ml Erlenmeyrova banka sa naplní 100 m 1 média obsahujúceho minerálne soli, ktoré obsahuje 1 mmol kyseliny G-metylnikotínovej (tabuľka 1) a zmieša sa s 10 m 1 kalu z čistiacich zariadení firmy LONZA AG vo Visp,Švajčiarsko alebo sa mieša so vzorkou pôdy z podniku LONZA, Visp a inkubuje sa v pokoji pri 30 °C. Po 10 dňoch sa v niektorých kultúrach mohla spektrofotometricky preukázať kyselina 2-hydroxy-ó-metylnikotínová. Tieto kultúry sa potom niekoľkokrát preočkujú do čerstvého média obsahujúceho minerálne soli. Potom sa bunkové suspenzie, ktoré tvoria kyselinu 2-hydroxy-6-metylnikotínovú nanesú na rovnaké médium, ktoré obsahuje 1,6(hmotn./obj.) agaru. Agarove doštičky sa potom inkubujú pri 30 °C v atmosfére, ktorá obsahuje 4 O 2 a 96 N 2. Jednotlivé kolónie sa prenesú do kvapalného média a inku bujú sa V pokoji. Bakteriálny kmeň s označením Ki 101(DSM 6920) vytvoril počas rastu na kyseline ó-metylnikotínovej kyselinu 2-hydroxy-6-metylnikotínovú.Príklad 2 Mikrobiologická oxidácia kyseliny nikotínovej na kyselinu Z-hydroxynikotínovúMikroorganizmy s označením Ki 101 (DSM 6920) sa inkubujú v 800 m 1 média obsahujúceho minerálne soli (tabuľka 1) s pridaním 8 mmol kyseliny ó-metylnikotínovej v 1 litrovej Fernbachovej banke pri 30 °C na trepačke pri 100 oL/min. (otáčky za min). Inokulum má 5 (obj./obj.). Po 5 dňoch je OD 650 približne 0,5. Potom sa bunky zoberú a jedenkràt sa premyjú 50 molárnym fosfátovým pufrom s hodntou pH 7,0. Potom sa bunky resuspendujú v 20 m 1 50 mM fosfátovom pufri s hodnotou pH 7,0., ktorý obsahuje 200 mg (1,38 mmol) sodnej soli kyseliny nikotínovej. OD 550 je 20. Po 6 hod. ínkubácie na trepačke pri 30 °C sa chromatograñou v tenkej vrstve už nedokázala kyselina nikotínová. Potom sa biomasa odstredí a supematant sa okyslí na hodnotu pH 2,5, aby sa kyselina 2-hydroxynikotínová vyzrážala. Pomocou lH-NMR (DMSO) analýzy sa nedokázala v izolovanom produkte žiadna nečistota. Spolu sa izolovalo 140 mg (1 mmol) kyseliny 2-hydroxynikotinovej, čo zodpovedá výťažku 72 , vzhľadom na kyselinu nikotínovú.Zásobne roztoky média obsahujúceho minerálne soli Zásobný roztok 1NaH 2 P 04 . 21-120 156,0 g NH 4 Cl 10,0 g K 2 SO 4 1,2 g pH upraviť s KOH na 7,0 destilovaná voda 500,0 m 1 Zásobný roztok 2 kyselina p-amínobenzoová 8,0 mg D-biotin 2,0 mg kyselina nikotínová 20,0 mg Ca-D-pantotenát 10,0 mg pyridoxalhydrochlorid 30,0 mg tíaminhydrochlorid 20,0 mg kyanokobalamin 10,0 mgsodná soľ kyseliny ó-metylnikotínovej 80,0 g destilovaná voda 1000,0 ml, autoklavovať, 121 °C, 20 min.Po sterilizácií sa pridáPríklad 3 až 7 Príklady 3 až 7 sa vykonávajú podľa príkladu 2. Výsledky sú zhmute V tabuľke 2.Prr- Východu un. nan- an. tu Prndukt wullnd tnntr. ak »was m nat Indnl le kyhäwb l Z 2 D lb kym SJv-dazhlúr- 20 X dichlúrnikuti- Z-hvdrclrnitntl- nu). nDVIj nuvil. Mikrobiologický spôsob hydroxylácie dusíkatých heteroxyklických karboxylových kyselín alebo ich rozpustných solí všeobecného vzorca (I)kde R 1 a R 2 sú zhodne alebo rozdielne a znamenajú atóm vodíka, atóm halogénu alebo C 1-C 4-alky 1 ovú skupinu a X znamená atóm dusíka alebo CF 3 skupinu, kde R 3 znamená atóm vodika alebo atóm halogénu, v y z n a č u j ú c i s a t ý m , že sa dusíkatá heterocyklická karboxylová kyselina alebo jej rozpustné soli všeobecného vzor ca (II) Iêľkde R a R 2 a X majú uvedený význam, ako substrát, premenia pomocou mikroorganizmov zužitkujúcich kyselinu ó-metylnikotínovú a obsahujúcich špecifickú hydroxylázu,na produkt všeobecného vzorca (I) 2. Spôsob podľa nároku l, v y z n a č u j ú e is a t ý m , že sa ako substrát použijú dusíkaté heterocyklicke karboxylove kyseliny všeobecného vzorca (II)kde R 1 a R 2 sú rovnaké alebo rôzne a znamenajú atóm vodíka, atóm Chlóru alebo metylovú skupinu a X znamená atóm dusíka alebo CH skupinu.3, Spôsob podľa aspoň jedného nároku 1 a 2, v y z n a č uj ú ci s a tým ,žesareakciavykonáva s mikroorganizmami označenými Kil 01 DSM 6920 alebo ich descendentami a mutantmi.4. Spôsob podľa aspoň jedného nároku 1 až 3, v y z n a č uj ú ci s a t ý m ,žesareakciavykonáva pri jednorázovom alebo kontinuálnom pridaní substrátu tak, že koncentrácia substrátu nepresiahne v kultivačnom médiu 10 hmotnostných.5. Spôsob podľa aspoň jendého nároku l až 4, v y z n a č uj ú ci s a t ý m ,žesareakciavykonáva pri teplote od 15 do 50 °C a pri pH od 5 do 9.6. Mikroorganizmy, ktoré zužitkovávajú kyselinu 6-metylnikotínovú ako jediný zdroj uhlíka, dusíka a energie cez kyselinu 2-hydroxy-6-metylníkotínovú.7. Milcroorganizmy, podľa nároku 6 s označením Ki 10 l uložené pod DSM 6920 a ich descendenty a mutanty, zachovávajúce si schopnosti pôvodného mikroorganizmu. 8. Dusíkate hydroxyheterocyklické karboxylové kyseliny všeobecného vzorca (l)v ktorom ked X znamená atóm dusíka, R 1 a R 2 sú rovnaké alebo rôzne a znamenajú atóm vodíka, atóm halogénu alebo C 1-C 4-alkylovú skupinu s výnimkou, že R 1 a R 2 neznamenajú spoločne atóm vodika a ked X znamená CH skupinu, R a R 2 znamená atóm chlóru.

MPK / Značky

MPK: C12N 1/20, C07D 213/80, C07D 241/24, C12P 17/12

Značky: mikrobiologický, karboxylových, kyselin, hydroxylácie, dusíkaté, heterocyklických, spôsob, karboxylové, hydroxyheterocyklické, kyseliny, dusíkatých, ki101, mikroorganizmy

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-279322-mikrobiologicky-sposob-hydroxylacie-dusikatych-heterocyklickych-karboxylovych-kyselin-mikroorganizmy-ki101-dsm-6920-a-dusikate-hydroxyheterocyklicke-karboxylove-kyseliny.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Mikrobiologický spôsob hydroxylácie dusíkatých heterocyklických karboxylových kyselín, mikroorganizmy Ki101 DSM 6920 a dusíkaté hydroxyheterocyklické karboxylové kyseliny</a>

Podobne patenty