Mikroorganizmy Agrobacterium sp. a spôsob mikrobiologickej výroby kyseliny 6-hydroxynikotínovej

Číslo patentu: 278571

Dátum: 14.10.1992

Autor: Kiener Andreas

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný spôsob mikrobiologickej výroby kyseliny 6-hydroxynikotínovej z 3-kyanpyridínu. V tomto spôsobe sa používajú nové mikroorganizmy rodu Agrobactérium, ktoré sú schopné rásť s 3-kyanpyridínom ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie a ako substrát ho biotransformovať na kyselinu 6-hydroxynikotínovú. Opisujú sa tiež mikroorganizmy Agrobactérium sp. DSM 6336.

Text

Pozerať všetko

Číslo príorimej prihlášky 811/91-7 (51) In CUKrajina priority CH (C 12 N 1/20 ÚRAD Dátum zverejnenia 14.10.92 C HR 101) Dátum zverejnenia udelenia vo Vestníku 08.10.97 SLOVENSKEJREPUBLJKY(73) Majiteľ patentu Lonza A.G., Gampel/Wal 1 is(Dir. Bassel), CH(72) Pôvodca vynálezu Kiener Andreas, Dr., Vísp (Kanton Wallis), CH(54) Názov vynálezu Mikroorganizmy Agrobactérium sp. a spôsob mikrobiologickej výroby kyseliny ő-hydroxynikotínovejJe opisaný spôsob mikrobiologickej výroby kyseliny 6-hydroxynikotinovej z S-kyanpyridlnu. V tomto spôsobe sa používajú nove mikroorganizmy rodu Agrobactérium, ktoré sú schopné rásť s 3-kyanpyridinom ako jediným zdrojom uhlíka,dusíka a energie a ako substrát ho biotransformovať na kyselinu ó-hydroxynikotínovú, Opisujú sa tiež mikroorganizmy Agrobactérium sp. DSM 6336.Vynález sa týka mikrobiologickćho spôsobu výroby kyseliny ó-hydroxynikotínovej z 3-kyanpyridínu a nových mikroorganizmov vhodných na tento spôsob výroby.Kyselina ó-hydroxynikotínová je dôležitý medziprodukt na výrobu kyseliny iG-dichlómikotínovej, švajčiarsky patentový spis 664 754, ktoráje opäť východiskovým produktom na farmaceutický účinných látok. Setcliñ a spol, J. of Chem. And Eng. Data, zv. 21, č. 2, (1976), str. 246.Spôsob výroby kyseliny ó-hydroxynikotinovej z 3-kyanpyridinu nie je dosiaľ známy, ani chemickou cestou,ani mikrobiologickou cestou.Úlohou predloženého vynálezu je dať k dispozícii jednoduchý mikrobiologický spôsob výroby kyseliny 6-hydroxynikotínovej z 3-kyanpyridínu.Úloha bola vyriešená novým spôsobom podľa patentového nároku 2, ktorý sa uskutočňuje pomocou nových mikroorganizmov podľa patentového nároku l.Podľa vynálezu sú vhodné všetky mikroorganizmy,ktoré sú schopné rásť s 3-kyanpyridínom ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie a ten ako substrát premeniť na kyselinu 6-hydroxynikotínovú.Tieto mikroorganizny sú súčasťou vynálezu a je možné ich pomocou obvyklých mikrobiologických postupov oddeliť a izolovať pomocou 3-kyanpyridínu ako rastovćho substrátu, napríklad z čistiacich zariadení.Pojem mikroorganizmy, ktoré sú schopne rásť s 3-kyanpyridínom ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie, zahmuje tak zmesi mikroorganizmov, ako aj čisté izoláty týchto mikroorganizmov, ktoré sa používajú n sterilných alebo nesterilných fermentačných podmienok.Účelne sa používajú mikroorganizmy Achramabacter sp., ktoré sa na základe podrobnejších identifikačných dát ďalej označujú ako Agrobacterium sp., a ich descendenty a mutanty. Tieto mikroorganizmy boli uložené 31. 1.1991 do Nemeckej zbierky mikroorganizmov a bunkových kultúr GmbH (DSM), Mascheroderweg ib, D-3000 Braunschweig pod označením DSM 6336. Vedecký opis mikroorganizmov Agrobactérium (DSM 6336)Vlnslmui Iamm bunkovú forma tyčinky App HM »Am 0.541 s dlzka um Ls-iu ADC pohyblivou -v oNPG Gram-nekdo . w lýza a ss-ným KOH amimpeptidáza (Cemí) |mg|PÓW - N 0 z z N 03 midi o denlmnkida o kalalâu íenyialanimhsamiiàzn k. w. Fill lsemndza amuáhny . 37 I 41 C 4/- Iván w pH 5.6 M 5049 RGY-Mir Simmonuv citrúł SS-Igar . nełrimíd-aguv - malonàl . 2 i NaCI r ketolaktóza . pigmenty nediłundujún - nyumýn dilund Ljúeo - škmbu . lłuureskujúoe žqaľny . nvokvnnh Iiazelnu . DNA ~ kyselina z (OF-test) Twggm ao dukúzy aarćbns eahulinu -o gukúzy anaerőbru allrdizácía plyn z slukňzv lshnmavćho mlieka kľilĺĺni Z (KSS) potreba nastava látky glukózy 4 MW využitie subetràlu xvlózv aoełát m-erytrilolu adipát meleuwzy - ksprňł arabinózy dum mamy - 9 mm . calobiúzy nami 4 trehalózv levulinài HMWĎZY malú 4 Úuldm - malonál snmhu łanylaactàt W 091 i suberit L-arabinózy índdózy glukózy manbzy o mnltózy M 6 sacharúzy snrhúzy . rmnitu Z-katoglukaülu N-acetylqlukőzamlnu L-whu hydroxybutyram L-Iyzlnu 4 L-ornitinuSpôsob výroby kyseliny ó-hydroxynikotínovej sa podľa vynálezu uskutočňuje tak, že sa 3-kyanpyridin biotransformuje jedným z týchto mikroorganizmov na kyselinu 6 ~hydroxynikotínovú, a tá sa akumuluje V médiu.Pred vlastnou reakciou sa mikroorganizmy kultivujú(pestujú) obvyklým spôsobom a účinné enzýmy mikroorganizmov sa účelne indukujú 3-kyanpyridínom.Obyčajne sa kultivácia (pestovanie) a indukcia uskutočňuje s 3-kyanpyridínom s koncentráciou od 0,01 do 20 hmotnostných, výhodne s koncentráciou od 0,1 do l hmotnostného.Potom sa môžu mikroorganizmy pred pridaním substrátu (3-kyanpyridínu) izolovať bežnými deliacimi postupmi, alebo sa substrát (3-kyanpyridín) môže pridávať priamo k mikroorganizmom.Pre vlastný spôsob výroby sa potom bunková suspenzia upraví na hodnotu optickej hustoty pri 650 nm od 1 do 100, výhodne na hodnotu optickej hustoty od 5 do 80.Ako medium sa môžu použiť v odbore bežne používané médiá. Výhodne sa používa jedno z médií, ktorých zloženie je uvedene V tabuľke 1 a 2.Substrát 3-kyanpyridín sa na výrobu kyseliny 6-hydroxynikotínovej može pridávať jednorázovo alebo kontínuálne. Substrat sa účelne pridáva tak, aby koncentrácia substrátu v médiu nepresiahla 20 hmotnostných,výhodne sa pridáva tak, aby koncentrácia substrátu nepresiahla 10 hmotnosti. Obyčajne sa premena 3-kyanpyridínu na kyselinu ő-hydroxynikotínovú uskutočňuje s bunkami V pokoji.Hodnota pH reakcie je účelne v rozmedzí od 4 do 10,výhodne v rozmedzí od 5 do 9.Reakcia sa uskutočňuje pri teplote od 10 do 50 °C,výhodne pri teplote od 20 do 40 °C.Po obvyklom reakčnom čase od 1 do 100 hodín je možne izolovať kyselinu 6-hydroxynikotínovú napríklad okyslením bezbunkového fermentačného roztoku.Príklad 1 Izolácia mikroorganizmov metabolizujúcich 3-kyanpyridínAeróbnć mirtoorganizmy metabolizujúce 3-kyanpyridín sa namnožia v AN-médiu (tabulka l) s prídavkom 0,1 hmotnosti/objem 3-kyanpyridínu ako jediného zdroja uhlíka a energie. Všeobecne metódy na izoláciu mikroorganizmov sa opisujú napríklad v G. Drews, Mikrobiologisches Praktikum, 4. Vydanie, Springer Verlag,1983. Ako ínokulum sa používajú vzorky z čistiacich zariadení.Narastené kultúry sa pestujú v trepacích bankách pri 30 °C. Po trojnásobnom preočkovaní do čerstvého média sa narastené kultúry rozotrú na rovnaké médium s prídavkom 16 g agaru na liter a inkubujú sa pri 30 °C. Po viacnásobnom rozotrení na agarove médium je možné izolovať kultúry.(M 0250 20 m Nngwm 2 on 0 nazve. ipm NIC sono S 011 - 9 N 20 4 m na . z N 30 14.5 Fuclg . o N 10 a.a wrłdnuhydroaum mur 3 mnm . 5 v 3 rid many nmnmj sto-s iumlnhydrraełlołh 2.104 mm 2.104 kyniul pumourmi sro mumwuon 5.10 try-amy html 2.104 vrumm B 1 5.104 znso 7 N 20 100.103 unclg . 4 N 10 nom-ľ M 3503 300.103 C 9011 - I N 20 mnm cum . 2 Hgo mur na n M 30 20.1174 Magma z N 30 ano-J simon . 2 M 20 nu-í FcS 04. 7 M 10 210-5a) Agrobacterium sp. DSM č. 6336 sa pestuje vo fermentore v AN médiu (tabuľka l) za pridania 0,1 hmotnosti/objem 3-kyanpyridínu pri hodnote pH 7 a pri teplote 30 °C. Potom sa bunky odstredia, resuspendujú v AN-médiu a optická hustota sa upraví pri 650 nm na hodnotu 10. Táto bunková suspenzia sa vleje do trepacej banky a zmieša sa s 0,1 mol/l (10,4 g/1) 3-kyanpyridínu. Po 16 hodinovej inkubácii pri 30 °C na trepacom zariadení je možné pomocou analytických metód v bczbunkovom roztoku dokázať 0,06 mol/l (8,3 g/l) kyseliny 6-hydroxynikotínovej To zodpovedá 66 Vo-nemu výťažku,vztianute na vnesený 3-kyanpyridín.b) Agrobacterium sp. DSM č. 6336 sa pestuje vo fermentore (pracovný objem 5,5 l) v médiu obsahujúcom minerálne soli (tabuľka 2) za pridania 0,1 hmotnosti/objem 3-kyanpyridínu pri hodnote pH 7 a pri teplote 30 °C. Na úpravu pH sa pridá roztok tvorený l mol/l kyseliny sirovej a 2 mol/l 3-kyanpyridínu a roztok 3 mol/l hydroxidu sodneho. Po 20 hodinách rastu (kultivácie) bola hodnota optickej hustoty pri 650 nm 5,0, pričom 3-kyanpyridín ani kyselina ó-hydroxynikotínová, už nie sú použítou analytickou metódou dokázateľne. V tomto okamihu sa do fermentora pridá 3-kyanpyridín (100 g, 1 mol). Po ďalšej 6 hodinovej inkubácii sa ešte raz pridá 3-kyanpyridin (100 g, l mol). Po ďalších 12 hodinách sa odstredí suspenzia mikroorganimov (biomasa) a supernatant sa okyslí na hodnotu pH 2,0, aby sa vyzrážala kyselina 6-hydroxynikotinová. Celkom sa izoluje 269 g kyseliny ó-hydroxynikotínovej, čo zodpovedá výťažku 96, vztiahnuté na vnesený 3-kyanpyridín.3-kyanpyridínu na kyselinu ó-hydroxy Tabulka 2 Zloženie média obsahujúceho minerálne solíZloženie stopových prvkov (SLF) v médiu obsahujúcom minerálne soli(pH roztoku sa uprlvl na hodnotu 7.0).1. Mikroorganízmy s označením Agrobactérium sp. uložené v DSM číslo 6336, ktoré sú schopné rásť s 3-kyanpyridlnom ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie a ten ako substrát premeniť na kyselinu 6-hydroxynikotínovú.2. Spôsob mikrobiologickej výroby kyseliny 6-hydroxynikotínovej v y z n a č uj ú ci s a tý m, že sa 3-kyanpyridín biotransformuje ako substrát s mikroorganizmami rodu Agrobactérium, ktoré sú schopné rásť s 3-kyanpyridinom ako jediným zdrojom uhlíka, dusíka a energie na kyselinu ó-hydroxynikotínovú, ktorá sa akumuluje V médiu.3. Spôsobpodľanárokulvyzn ačujúci sa t ý m, že sa premena uskutočňuje s míkroorganizmami druhu Agrobactérium sp. DSM 6336 a/alebo s ich spontánnymi mutantmi, ktoré si zachovávajú funkčnú schopnosť materského mikroorganizmu.4. Spôsob podľa nároku 2 alebo 3, v y z n a č uj ú c i s a t ý m, že sa účinné enzýmy mikroorganizmov indukujú 3-kyanpyridínom.5. Spôsob podľa aspoň jedného z nárokov 2 až 4, v y z n a č uj ú ci s a t ý m, že sa premena uskutočňuje pri jednorázovom alebo kontinuálnom pridávaní substrátu tak, že koncentrácia substrátu nepresiahne 20 hmotnosti.6. Spôsob podľa aspoň jedného z nárokov 2 až 5, v y z n a č uj ú ci s a t ý m, že sa reakcia uskutočňuje pri hodnote pH od 4 do 10 a pri teplote od 10 do 50 °C.

MPK / Značky

MPK: C12P 17/12, C12N 1/20

Značky: mikrobiologickej, agrobacterium, spôsob, 6-hydroxynikotínovej, výroby, mikroorganizmy, kyseliny

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-278571-mikroorganizmy-agrobacterium-sp-a-sposob-mikrobiologickej-vyroby-kyseliny-6-hydroxynikotinovej.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Mikroorganizmy Agrobacterium sp. a spôsob mikrobiologickej výroby kyseliny 6-hydroxynikotínovej</a>

Podobne patenty