Diploidné bunky LEP 19 pre využitie vo farmácii a medicíne

Číslo patentu: 277857

Dátum: 02.02.1994

Autori: Macek Milan, Řezáčová Dagmar

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Vynález sa týka tkaninovej kultúry ľudských diploidných buniek LEP 19 na využitie vo farmaceutickom priemysle, humánnej a veterinárnej medicíne, uložených v Čs. štátnej zbierke typových kultúr Štátneho zdravotného ústavu v Prahe pod č. AO 38/92. Tieto bunky vykazujú špecifické vlastnosti z hľadiska druhovej identity, stálosti, karyologicky diploidného charakteru, morfológie, rastových vlastností, obmedzenej životnosti, neonkogénnosti, neobsahujú mikrobiálnu a vírusovú kontamináciu a sú vhodné na virologickú diagnostiku, výrobu antigénov, výrobu a kontrolu vírusových vakcín, vo farmaceutickom priemysle, humánnej a veterinárnej medicíne.

Text

Pozerať všetko

Krajina priority ÚRAD Dátum zverejnenia 09.02.92 PRIEMYSELNÉHO VLASTNÍCTVA Dátum omámenia o udelení vo Vestníku 10.05.95 SLOVENSKEJ REPUBLIKY(73) Majiteľ patentu SEVAC a. s., Praha CZ(72) Pôvodca vynálezu ŘEZÁČOVÁ Dagmar MUDr., Praha, cz(54) Názov vynàlezu Diploidne blmky LEP 19 na využitie vo fannácii a medicínaVynález sa týka tkaninovej kultúry ľudských diploidných buniek LEP 19 na využitie vo farmaccutickom priemysle,humàxmej a veterinárne) medictne, uložených v Čs. štátnej zbierke typových kultúr Štátneho zdravotného ústavu v Prahe pod č. AO 38/92. Tieto bunky vykazujú špecifické vlastnosti z hľadiska druhovej identity, stálosti, kanologicky diploidného charakteru, morfológie, rastových vlastnosti, obmedzenej životnosti, neonkogétmosti, neobsahujú mikrobiálnu a vímsovťn kontamináciu a sú vhodné na virologickú diagnostiku, výrobu antigćnov, výrobu a kontmlu vírusových vakcin, vo farmaceutickom priemysle, humáimej a veterinámej medícíne.V súčasnej dobe sa vo svete pre farmaceutický priemysel, humannu a Veterinárna medicínu používajú diploidné bunky derivované zo živočíšnych tkanív, ktoré majú špecifické štandartné vlastnosti, vyhovujúce prísnym zdravotníckym požiadavkam.Metóda prípravy týchto buniek pre priemysel je všeobecne mama, charakter imunobiologického materiálu však spôsobuje, že získanie bunečných línii stabilných vyhovujúcich vlastností je veľmi obťažmé. Naviac je každá bunečnà línia jedinečná vzhľadom na to, že zdmj na pripravu takejto línie je jedinečný. l ked nie sú výhody danej línie vždy ilmed jasné, nedá sa nikdy vylúčiť, že sa až v priebehu ich využívania prejavia ich ďalšie prednosti, alebo že sa objaví ich iná neopakovateľnú vlastnosť.Wl-38, derivovane v r. 1961 L.Haytlickom (Exp. Cell Res. 251585, 1961). Bunky neobsahujú mikrobiúlne a vírusové kontaminácie, sú karyologicky díploidnćho charakteru a nejavia onkogénne vlastností. Obsahujú izoenzým G 6 PD typ B. Citlivosť na vírusy rhino, polio l, herpes simplex, pseudombies, VSV (Indiana strain),atď.MRC-5, derivované v r. 1966 J.P.Jacobsom (Nature 227 168-170, 1970). Bunky neobsahujú mikrobiálne a vírusovć kontaminacie, sú karyologicky diploidného charakteru a nejavia onkogénne vlastnosti. Obsahujú izoenzým GóPD typ B. Citlivosť na vírusy polio 1, herpes 1, herpes simplex, VSV (Indiana str.) atď.1 MR-90, derivovaně W.W.Nicholsom (Science 1966063, 1977). Bunky neobsahujú mikrobiálne a virusové kontaminácie, sú karyologicky diploidného charakteru a nejavia onkogćnne vlastnosti. Obsahujú G 6 PD typ B. Citlivosť na vírusy polio l-3, herpes simplex 1,2, varicella zoster, VSV CMV, vaccinia, atď.Tieto btuiky sa dostávajú do fannaceutíckćho a zdravotníckeho terénu od výrobcu po pomnožení spravidla vo vyššej pasáži, keď je ich životnost značne obmedzená a nie sú preto už Spôsobilé stát so zdrojom na vlastnú produkciu u iného výrobcu. Každý výrobca si tiež vo vlastnom záujme chráni svoj zdroj pred odcudzením,takže pripadní záujemcovia o výrobu sú odkázaní na priamy odber živolaschopných buniek, čo je vždy veľmi nákladné.Podstata vynálezu spočíva v tom, že diploidnć bunky LEP 19, uložené v Československej štátnej zbierke typových kultúr SZU pod č. A 0 38/92, ktore bolí prípravené v Ústave ser a očkovacích látok, Praha, vykazujú špecifické vlastnosti z hľadiska druhovej identity, stá 10losti diploidnćho charakteru, morfológie, rastových vlastností, obmedzenej životnosti a neonkogérmosti a tieto vlastnosti sú schopné si udržať i po dlhodobom uchovávanl v tekutom dusíku.Uvedené bunky boli pripravené z pľúc trojmesačného normálneho ernbrya získaného z interupcie u zdravého jedinca. Primo-kultúra bola založená z malých tlagmentov pľúcneho tkaniva, ktoré boli urniestnené v pravidelných vzdialenostiach na kultivačnej ploche fľašky. Po prichytení ku kultivačnérnu povrchu boli fragmenty tkaniva opatrne prevrstvené médiom a inkubované pri 37 °C. Po dvoch týždňoch inkubácie pri pravidelnej výmene média sa bunky okolo ragmentov roz-ástli natoľko, že bolo možne uskutočniť prvú pasáž trypsírtom. Po niekoľkých ďalších pasážach bola časť bunečnej suspenzie naplnená do ampuliek, zmrazzená a uložená do kontajneru s tekutým dusíkom ako primárny Seed buniek slúžiaci ako východisková zásoba buniek na ich ďalšie využitie.Bunky LEP 19 majú vretenový tvar, jedno jadro s jedným až štyrmi jadierkami, ich tvar sa nezmení prakticky až do 60. generácie. Rastú v charakteristio kých víroch a táto morfológia kultúry zostáva zachovaná po celú dobu ich ävomosti, ktorá je okolo 60 generácii v médiu EPL alebo MEM s 10 bovinného sera a s kanamycinom. Bunky sa pomnožujú pravidelne zhruba 1,5 x počas 72 hodín kultivácie pri 37 °C.Bunky sú citlivé na tieto vírusy rhino, herpes, paramyxo, adeno, CMV, ECHO, VZ a ďalšie.Bunky LEP 19 boli testované podľa WHO prednnrazením a znovu po zmrazení. Splňajú všetky súčasné požiadavky na HDCS dopomčené WHO (WHO Expert Committee on Biol. Standardization. Technical Report Series 687, WHO Geneva 1983). Výsledky preverenia sú uvedené nižšie v tab. l. Takto dokonale v medzinárodne uznávaných testoch (WHO) preverené bunky LEP 19 sú v dostatočnej zásobe(celkom 150 ampuliek) zaisťujúce ich štandardnú produkciu na desiatky rokov.Bunky LEP 19 sa dajú výhodne použiť vo farmaceutickom priemysle, v humarmej a veterinámej medicíne na diagnostiku, izoláciu vímsov, výrobu antigćnov, výrobu vakcín a ich kontrolu, na cytotoxickć testy atd. Tab. č.1um mitm wo pre nact mnoprtlnnult eudzten vírusov r cupreuuodnýn ensure-ý .faktu n mnm. 1 nsoaosoŕbčnnu a hnugíunnnensu nuzwnusrepettunnos euazlcn vPuscv 9 nosa-Jaký arena Vo .vlani aruny rx tvro. ot. Llcvn. netu)ncnrtccuncst uvcunuuruun ním Masusancu an uukoanost buniekFragmenty pľúcneho tkaniva veľkosti asi l mm boli prenesené do kultivačnej fľašky (približne jeden tragment na 1 cm plochy) a opatrne navlhčené médiom. Po 24 hodinách inkubácie pri 37 °C, keď už boli fmgmenty tkaniva prichytené na skle, pridalo sa väčšie množstvo média a kultúra sa inkubovala dva týždne pri 37 °C. Dvakrát týždenne sa na kultúre vymieňalo médium. Keď bunky vytvorili okolo ůagmentov prstenec široký asi 1 cm, vykonala sa prva pasàž, a to priamo v kultivačnej tlaške. Strypsinizované bunky narástli do súvislej vrstvy v priebehu štyroch dní. Pri ďalších pasážach boli trypsínom uvoľnené bunky rozdelené vždy z jednej fľašky do dvoch, tak aby pomer štiepenia bol 12 a fľašky sa doplnili médiom. Týmto spôsobom sa bunky pasàžxovalí dvakrát týžderme až do 6. pasáže, čím sa získalo 32 Roux íľašiek. Z 25 Roux fľašiek sa bunky po trypsinizàcíi zmrazili v ampulkách a uložili do kontajnerov s tekutým dusíkom. Tým bol vytvorený primámy seed buniek. Bunky sa kultivovali v médiu EPL s rastovými proteímni bovirmého sére. (SEVAC 111) a potom zmrazili v rovnakom médiu s 7,5 DMSO.Vírus VZ bol pomnožlený s vysokou multiplicitou infekcie v rýchle nasledujúcich rollerových pasážach(interval 48-72 hodín, multiplicita 12 alebo 13, čo znamená jednu infikovanú bunku na dve až tri biuiky čerstvého monolayem). Dobre narastená kultúra buniek LEP 19 v Roux fľaške 1200 ml (priememe 25,0 x 10 ° buniek) bola v poslednej pasáži pred inokuláciotr 3 x opláchnutá I-lanksovým roztokom. V dobe masívneho CPE (po 48-72 hod.) sa médium z fľašky vylialo a infikované bunky boli sklenenými guľôčkami strhané do 8 ml udržiavacieho média. Po cenlrifugácii v skúmavke pri 1000 g počas 20 minút bol supematant odstránený a sediment buniek z jednej Roux lľašky bol resuspendovaný v 1,5 m 1 Hanksovho roztoku. Táto buuečná suspenzia sa ultrasonikovala 4 minúty pri 20 kclsek. Takto úskaný antigén je stály pri skladovaní v mradacom pulte pri - 0 °C dlhšie ako jeden rok.Antigén sa používa v reakcii väzby komplementu, v teste ELISa, na test jednoduchej radiálnej hemolýzy atď.Izolovaný materiál bol odohrany z pľuzgierov chorého na varicellu zoster a vstrieknutý do skúmavky s odberovým médium. Po 3/4 hodinovej inkubácií pri laboratómej teplote bol inokulovaný v množstve 0,2 a 0,1 ml na dve skíunavky s narastenou kultúrou buniek LEP 19. Po hodinovej inkubácii pri laboratómej teplote boli skúmavky doplnené 1,5 ml udižovacieho média a vložené do rollerového bubna v tennostate s teplotou 37 °C. Izolačný pokus spočíva v pravidelnom prehliadaní kultúr v mikroskope , v sledovaní tvorby a rozvoji CPE počas troch týždňov. CPE sa prejavoval charakteristickou tvorbou ostrovčekov okrúltlych brmiek v okolitej fibroblastoidnej kultúre buniek 19, ktoré do istej miery pripomínali ložiská pľuzgierov msterového exantétnu. Vírus sa do skúmavky s čerstvým monolayerom buniek LEP 19 prenášal inñkovanými bunkami získanými trypsinizáciou predchádzajúcej pasáže infikovanej kultúry buniek LEP 19. Voľný vírus sa z infikovaných buniek LEP 19 uvoľnil krátkou ultrasonikáciou.Identifikácia iznlovaného vírusu VZ sa vykonala s ľudským rekonvalescentným sérom po ochorení na zoster. Ako konjugát slúžil SwAHu/Ig HTC-ÚSOL. serum i konjugát boli vysýtené práškom pripraveným lyotiliníciou buniek LEP 19 (40,0 x 10 buniek na 1 ml séra či konjugátu). Na skličku narastená kultúra buniek LEP 19 sa po umytí fosfátovým pufrom mliala pozitívnym sérom proti VZ a inkubovala 30 minút,movu umyla a opat inkubovala, zalinla konjugátom SwAHu/Ig FITC. Po konečnom opláchnutí bola namontovaná do glycerinu a prehliadnutá vo íluóresoenčnom mikroskope. Ako kontrola vírusu sa použilo sklíčko s narastenou kultúrou buniek LEP 19 infrkovanou vyšetrovaným vírusom, spracované rovnakým spôsobom so mmenenlm pozitívneho séra fosfátovýrm pufĺrom. Kontrolou séra boli neinfikované bunky LEP 19 spracované rovnakým spôsobom ako infikované a ako kontrola samotných buniek LEP 19 sa použilo sklíčko s narastenýrni neiníikovanými bunkami LEP 19, ktoré sa pri inak rovnakom spracovaní inkubovalí s fosfàtovým pufrom namiesto séra.Test potvrdil identitu vírusu VZ.Bunky LEP 19 slúžili na kontrolu vhodnosti použitia média H-MEM šarže 03-92 vyrobeného na stredisku TM 41 ÚSOL na TK metódu stanovenia PI, čo je pomer vyrastených a inokulovaných. Z PI buniek LEP 19 1., 2., a 3. pasáže boli vypočítané 0 Pl štandardného a kontrolného média, pričom 0 PI štandardného media dosahoval overené hodnoty z predchádzajúcich testov a bol pokladaný za 100. Testované sérum vyhovovalo požiadavkám. Jeho 0 Pl sa rovnal 109 PI buniek LEP 19 kultivovaných v štandardnom médiu H-MEM.Zoznam názvov k skratkám použitých v texte HDCS Human Diploid Cell StrainLEP 19 názov diploidnej línie ľudských buniek W 38 názov diploidnej linie ľudských buniek MRC-S názov diploidnej línie ľudských buniek lMR-90 názov diploidnej línie ľudských buniek Hela názov nádorovej línie ľudských buniek Vero názov heteroploidnej línie opičich buniek LLCMK názov heteroploidnej línie opičich buniek OL názov opičich btuiiekVSV vesicular stomatitis virusECHO enteric cytopathogenic human orphan WHO World Health OrgenizationSZÚ Štátny zdravotný ústav, PrahaÚSOL Ústav ser a očkovacich látok, PrahaELISA enzyme linked immunosorbent assay DMSO dimetylsulfoxidMEM kultivačné médium pre TK, ÚSOL H-MEM kultivačné médium pre TK, Úson EPL SEVAC lll kultivačne médium pre TK, USOLDiploidné bunky LEP 19 sú určené na využitie vo farmaceutickom priemysle humánnej a veterinámej medicíne.Diploidné bunky LEP 19 na využili vo famiácii a medicína, uložené v Čs. štátnej zbierke typových kultúr Štátneho zdravotného ústavu v Prahe pod označením AO 33/92.

MPK / Značky

MPK: C12N 5/08, A61K 35/48

Značky: medicině, využitie, buňky, diploidné, farmácii

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-277857-diploidne-bunky-lep-19-pre-vyuzitie-vo-farmacii-a-medicine.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Diploidné bunky LEP 19 pre využitie vo farmácii a medicíne</a>

Podobne patenty