Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

.. PLACHÝ JIŘÍ dr. CSc., ROZTOKY u Prahy, ULBERT STANISLAV ing.,(75) ČULÍK RAREL dr. , PRAHA, HANO ALEXANDR, BUČKO MICHAL ing. CSc.,BANSKÁ BYSTRICA, VLČEK VLADISLAV, SMÉKAL FRANTIŠEK dr. CSc., PRAHA, Autor vynálezu PILÁT PETR ing. css., PRAHA(54) Kmen mikroorgnniamu Brevibacterlum flovum CCM 3902(57) Účelem řešení je produkce esenciální aminokyseliny lysinu v médiu sa sacharosou jako zdrojem uhlíku. Lysin syntetizuje a v médiu hromadí mutanta bakteriálniho druhu Brevibacterium flavum. Působenim mutagénu a aplikací selektivnich médií byla izolována mutanta rezistentní k S-(2-aminoethyl)-L-cysteínu, dependentni na homoserin a leucin a citlivá na 2-f 1 uorpyruvát sodný, která kultivována 4 dny v médiu se eacharosou jako zdrojem uhliku, hydrolyzátem arašidové mouky a kukuřičným výluhem jako zdroji organického a síranem amonným jako anorganickým zdrojem dusiku a s minerálními solemi hromadila při vysoké konverzi za aerobnich podminek při 28 °C a neutrálním pH v prostředí58 g/L L-lysinu. Lysin, využívaný především jako doplněk krmív, lze takto vyrábět s využitím mikroorganismů běžnýmí technologickýmivynález se týká nového kmene mikroorganismu druhu Brevibacterium flavum rezistentniho k analoqu lysinu, dependentniho na homoserin a leucin a citlivého na 2-fluorpyruvát, který v médiu s vhodným zdrojem uhlíku a dusiku hromądil při vysoké konverzi uhlíkatého zdroje za aerobních podmínek a při neutrálnim pH vysoká množství lysinu.Při fermentačni přípravě lysinu jsou jako produkčni organismy využívány mutanty koryneformních bakterií s více genetickými znaky, které jsou mutantami auxotrofně-regulačnimi,vykazujícími ještě citlivost k inhibitorům kličových enzymů biosyntázy lysinu. S cílem izolovat takové mutanty byly izolovány mutanty druhu Brevibacterium flavum, které kromě reziatence k analogu lysinu, tj. k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu a dependence na homoserin a leucin jsou citlivé na 2-flourpyruvát sudný. S mutantou Brevibacterium flavum rezistentni k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu a citlivou na fluorpyruvát bylo v médiu s glukosou jako zdrojem uhlíku dosaženo produkce 51 g/L L-lysinu (ozaki, H.-Shiio, I. Agric. B 101. Chem. 471569, 1983).Výše produkce lysinu je závislá na optimálnim poměru dehydrogenázy a karboxylázy pyrohroznově kyseliny, které jako enzymy metabolismu glukózy reprezentuji zároveň kličové enzymy biosyntézy lysinu. Tyto enzymy rozhoduji totiž o tom, zda bude pyruvát využít V energetíckém metabo 1 ismunehpbude přednostně v přítomnosti nadbytku biotinu a při inhibici dehydroqenázy,vyvolané fluorpyruvátem, metabolizován karboxylázou, aktivovanou biotinem, na oxalacetát, z něhož se tvoří asparagová kyselina - výchozi sloučenina biosyntézy lysinu u baktérií (Tosaka, 0.-Takinami, K. Agric. Biol. Chem. 4295, 1978 Tosaką, Ok-Yoshipara, Y.-Ikeda, S.-Takinami, K. Agric. Biol. Chem. 4921305, 1985).Produkci lysinu převyšuje dosud známé kmeny kmen Brevibacterium flavum CCM 3982, který je předmětem vynálezu. Hlavní přednosti nového kmene podle vynálezu je jeho schopnost produkovat vysoká množství lysinu při vysokém stupni konverze uhlikatého zdroje. Při kultivaci nového kmene v produkčnim médiu se sacharózou jako zdrojem uhliku, 5 kyselým hydrolyzátem arašídové mouky a kukuřičným výluhem jako komplexnimi a siranem amonným jako anorganickým zdrojem dusíku a s minerálnimi solemi byly zaznamenány po Adenni kultivaci při 28 OC a pH udržovaném vodným roztokem čpavku na hodnotě 7,0 produkce lysinu 58 q/L při konverzi 40 .Nový kmen Brevibacterium flavum CCM 3982 je charakterizován následujicími morfologicko-kultivačními a fyziologickými vlastnostmiGrampozitivní, nepohyblívé, nesporulujicí kokky až krátké tyčinky, vyskytující se jednotlivě i v nepravidelných shlucích.Na masopeptonovém agaru tvoří okrouhlé, žluté kolonie s rovnými okraji na masopeptonovém šikmém agaru vytváří intenzivní žlutý nárůst po celém povrchu agaru V bujônu je možno pozorovat zákal a sediment, blanka se netvoří.Fyziologické vlastnosti optimální teplota - 28-30 OC, optimální pH - 6,8-7,2, aerobni organismus, želatinu neztekucuje, celulôzu nerozkládá, zkvašuje gluközu, fruktözu, sacharözu,škrob nehydrolyzuje, dusičnany redukuje, sirovodik netvoří, indol netvoři.Test na katalázu pozitivní.Buněčná suspenze výchozího kmene Brevibacterium flavum CCM 3736 rezistentniho k S-(2-amincethyl)-L-cysteinu a dependentniho na homoaerín a leucin, vyrostlá v kompletním médiu, se vy 3 264856staví po promytí fosfátovým pufrem (pH 7,2) 18 hodinovému působení 0,D 5 M ethylmethansulfonátu a suspenzí po aplikaci mutagénu a po pzomytí sterilni destilovanou vodou se očkuje baňkas kompletním médiem. 24 hod. promytou a naředěnou suspenzí se očkuji plotny s minimálním médiem doplněným homoserinem a leucinem a plotny s minimálním médiem stejně ohohaceným, ale obsahujícím ještě 2-fluorpyruvát sodný. Mutanty citlivé na fluorpyruvát se podrobují - po zjištění stupně rezistence k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu, dependence na homoserin a leucin a citlivosti na fluorpyruvát - produkčnímu hodnocení v produkčním médiu se sachorózou,hydrolyzátem arašídové mouky, kukuřičným výluhem a minerálními solemi, očkovaném inokulem vyrostlým V médiu se sacharózou, octanem sodným a kukuřičným výluhem.Podrobnosti vynálezu vyplývají z následujících příkladü provedeníMikroorganismus Brevibactierum flavum CCM 3736 se očkuje E 0 ml kompletního média V 500 ml varné baňce. složení kompletního média je následujícíroztok solí 1 ml/1000 ml média aqar (do tuhých médií) 2,5(Roztok solí je roztok 0,5 g Peso .7 H O a 0,5 g Mnso .4 H O ve 100 ml vody.) 4 2 4 ZZaočkovaná bañka se inkubuje na rotační třepačce (frekvence - 3,7 Hz, výstředník -25 mm) 24 h pŕi 28 °C. Buněěná suspenze se 2 x promyje fosfátovým pufrem (pH 7,2) a po promytí se vystaví 1 Bhod. působení 0,05 M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pnfru (pH 7,2). Po aplikací mutagénu se suspenze 2 x promyje sterilní destilovanou vodou a 5 (obj.) suspenze se očkuje 500 ml varná baňka se 60 ml kompletního média, která se inkubuje 24 h při 28 °C na rotační třepačce. Buněčná suspenze se 2 x promyje sterilní destilovanou vodou a vhodně naředěnou suspenzí se očkují plotny s minimálním méaieum doplněným 0,1 mg/ml L-homoserinu a 0,05 mg//ml L-leucinu. složení minimálního média je následujícíroztok biotinu 2 mg/1000 ml média roztok soli 1 ml/1000 ml média agar 2,5Kolonie, vyrostlé na plotnách po 3 dnech inkubace při 28 °C, se sterilními razidly přenese na plotny s minimálním médiem doplněným jednak homoserinem a leucínem, jednak homoserinem, leucinem a 0,1 mg/ml 2-fluorpyruvátu sodného. Mutanty citlivé na fluorpyruvát se vyočkují na šikmé masopeptonové agary a izoláty vyrostlé na agarech se jednak testují na stupeň rezistencek S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu, na dependenci na homoserin a leucin a na citlivost na 2-fluorpyruvát sodný, jednak se zjíštuje jejich schopnost produkovat lysin V produkčním médiu se saoharőzou, hydrolyzátem arašídové mouky, kukuřičným výluhem a minerálními solemi.Kulturou kmene Brevibacterium flavum CCM , 24 h starou, se očkuje 50 ml inokulačního média v 500 ml varných baňkách.uni inokulačního média sacharőza 2,0 cctan sodný 5,0 kukuřičný výluh (60 suš.) 3,0 pH 7,0zaočkované baňky se inkubují na rotační třepačce (frekvence - 3,7 Hz, výstředník - 25 mm) 24 hpři 28 °C. 12 (obj.) inokula se očkují 500 ml varné bañky s 20 ml produkčniho média následujícího složeníkys. hydrolyzát arašídové mouky 20,0 (obj.) kukuřičný výluh (60 sušiny) 1,0Během Adenní kultivace se pH upravuje 10 roztokem čpavku na hodnotu 7,0. Na konci kultivace se stanoví obsah lysinu a cukru V kultivačni tekutině. Lysin se stanovuje oscilopolarograficky a cukr jako glukóza s použitím analyzátoru glukózy Glucose Analyzer 2 (Beckman, USA).Produkce lysinu po 4 dnech kultivace činila 58 g/1 (konverze 40 ).Kmen mikroorganismu Brevibacterium flavum CCM 3982 rezistentní k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu, dependentni na homoserin a leucin, produkující při vysoké konverzi lysin, s citlivostí na 2-fluorpyruvát sodný.

MPK / Značky

MPK: C12N 1/20

Značky: mikroorganismu, brevibacterium, flavum

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-264856-kmen-mikroorganismu-brevibacterium-flavum-ccm-3982.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Kmen mikroorganismu Brevibacterium flavum CCM 3982</a>

Podobne patenty