Způsob enzymatické přípravy polynukleotidů purinové a pyrimidinové řady značených radioaktivním izotopem 14C resp. 3H

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

54 Zpłůeuh enzyłnzlatłiekéxňřípravipulyňuklàoíiàà purhąnłnvé a pyrimidinnvé řady značených radinaktivním izotupem 140, respektive HŘešení se týká způsobu GIIZYITIHÍÍCKŠ přípravý polynukleotidů puninové .a pynimídi rrové- řady značenýclr radioaktivníqn izotöpem MC, resp.- 5 H. -Padstata řešení spočívá V tom, že se použije enzym, který je prostý cizorodých bĺlkovin, zejména nízkomoleku- ~ ~ v lárních a že stupeň polymerace v průběhu e enzymové syntézy se zjišťuje detekcí radioaktivity složek reakční směsi. e evynález se týká způsobu připravy polynukleotidů značených radioizotopy 140, resp. 3 H 0 Vysoké molové aktivite.Postupným objasňováním úlohy polymuk leotidů V biologických funkcích živých organismů viz Field A. K. aj. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. 58, 1004 až 1009, 1967, Leviine S. aj. Bio Science 20, 696 až 708, 1970, Braun W. aj. Proc. Soc. Exp. Med. 119, 701 až 711,1965 se tyto sloučeniny staly nepostradatelné V molekulární biologii a příhuzných Vědních oborech.Počet mononukleotidových jednotek V polymeru se pohybuje v rozmezí 40 až 150. Proto jako metoda přípravy přichází V úvahu enzymová syntéza, nebot metodou chemické syntézy se dají připravit oligonnkleotidy nedosahující tak vysokého stupně polymerace.Nedostatkem stávajících postupů přípraVy je to, že enzymový preparát zpravidla obsahuje přiměsi cizorodých bíikovin, zejména nizkomolekuláruích, které mohou být obsaženy V malém množství v konečném produktu. jejich odstraňovaní nebýva kvau~ titativní, obsah se dá obtížné stanovit a jojich přítomnost je nežadoucí při aplikacích v- biochemických a biologických experimentech.Výše uvedené nedostatky odstraňuje způsob enzymatické připravy polynukleotidů purinové a pyrimidinové řady značené radioaktivním izotopem 14 C, resp. 3 H o vysoké molové aktivitě, jehož podstata spočíva V tom, že se použije enzym, který je prostý cizorodých bílkovin, zejména nízkomolekulárních, čehož se dosahuje jeho puritikací pomocí afinitní Chromatografia. Stupeň polymerace V průběhu enzymové reakce se zjišťuje detekcí radioaktivity složek reakčiíí směsi.Způsob podle vynálezu odstraňuje tuto nevýhodu, nebot použitím afinitní Chromatografie na polyU sepharose se získá čistá polynukleotidfosforyláza Polyribonucleotide Orthophosphate nucleotidyltransferase E. C. 2.7.7.8 která se použije k polymeraci. Příprava polynukłeotidů značených V molekule radioizotopem 140 na každém atomu uhíku nebyla dosud popsána.Radioizotopem 140 značené polynukleotidy mají výhodu nejen ve Vysoke mclové aktivitě, ale poskytují při aplikaci záruku, že je vyloučena možnost výměny radioizotopu s okolním prostředím. Průběh enzýmove syntézy polynukleotidů značených radioizotopy, zejména stupeň polymerace je usnadñován vyhodnocoväním radioaktivity reakčenich složek pomocí vysoce citlivých detek~ torů radíoaktivního záření.Enzym polynukleotidfosforyláza se získáVá z bakteriálních buněk různých mikroorganismů (Viz Šimúth j. aj. Biochim. Biophys. Acta, 379, 397 až 407, 1975 sklízených zpravidla V logaritmické fázi růstu.100 g buněk mikroorganismu, např. Esche« ríchia coli, Streptomyces aureofacciens a další se desintegruje V 500 m 1 puiru A°C 2 H 5 SH 0,01 mol . l 1,NH 4 j 2 S 04, NH 42 S 04 0,1 mo 1.11,Mgclz °MgG 12 0,006 mol . F 1, chelaton III °che 1. z 0,001 mol . i 41 a 5 giycerol.Supernatant se sráží přidáníin 5 polyethyleniminu. Po centrifugaci so sediment extrahuje dále 200 ml pufru A, obsahujícího síran amonný °(NH 42 S 04 0,2 mol . F 1. Suspenze se opě podrobí centritugaci při 30 000 xg. Supernatant se zředí pufrem A V poměru 11 a nenese na kolonu s DEAE celulózou DE-52 2,5 X 10 cm ekvililnrovanou síranem amonným °NH 42 S 04 0,1 mol , F 1 vv puiru A. Po nanesení vzorku na kolonu se kolona promývá síranem amonným o téže koncentraci V pufru A. Eluce se provádí lineárním gradientem síranu amonněho od °NH 42 SO 4 0,1 mo 1.l 1 do °NH 42 SO 4 0,5 mol.11 V pufru A. Frakce Vykazující aktivitu obvykle °NH 42 S 04 0,32 mol.l 1 se po dialýze oproti roztoku puiru B používá pro afinitní chro« matografii.Tris pufr Tris 0,05 mol.11, pH z 7,5 a chlorid hořečnaiý M 3012 r 0,001 11101.14. Afinitní chromatografieVýše uvedená frakce po DEAE celnlóze se podrobi afinitní chromatografii na poly« Usepharose 4 B 0,8 X 5 c 1 n. Kolona se před použitím uvede do rovnováhy roztokem chloridu draselného KCI 0,1 11101.14 V pufru B. Po nanesení vzorku na kolonu se kolona promyje roztokem chloridu draselného KCI 0,1 mol.11 V putru B. Eluuje se postupně roztoky chloridu draselného o koncentracíchFrakce vykazujíci aktivitu při koncentraci chloridu draselného KCI 0,6 mo 1.11 se dlalyzuje oproti puťru B obsahujicího chlorid draselný °KC 1 s. 0,2 mol .11. Po afinitui chromatografii se získa čistá polynukleotidiostoryláza, která se přímo použivá k polymeraci.K odparku radioaktivního nukleosid 5-difosfátu o hmotnosti 0,5 mol a radioaktivitě 71,5 kBq se přidá 90 l reakční směsi tohoto složeníTris 1,0 mol . 11 20 l EDTA EDTA 0,001 mol . l 1 1 l hďgclzýlĺřždy M Cl 0 1 1 l 1 10 1 čerstv ° g 2 , mo . IC 1 °Kc 1 1,0 mo 1.l 1 20 l NH 4 Cl °NH 4 Cl z 0,05 mol . l 1 1 l redestilo~ vvaná voda ç U 25 í.4 łĺ.t 77-ŤÁ 2 ~~§Ťíł.l 38 1K reakční směsi se přidá 10 l enzymu polynukleotidfosforylázy a směs se inkubuje v termostatu při teplotě 37 °C. V časových iutervalech se odebírají vzorky v množství cca Z l a nanášejí se na chromatograiický papír Whatmann, případně fólií s tenkou vrstvou sorbentu. Vyvijecí soustavou je octau amonný o koncentraci °CH 5 CDlJNHl 1,0 rnol.11 a 969/0 ethylalkohol ve stejných objemových poměrech. V průběhu enzymové reakce vzrůstá radioaktivita na startu poloha polynukleotidu a klesá radio aktivita Fř-difosfátu v místě příslušuého standardu .Doba Radloaktivita ĺkBq Stupeň konverze hod. U-Mcjpoly A U-14 C-5 ~ADP °/0Zpravidla se ukázala jako postačujíci enzymová reakce probihající po dobu 4 hodin.U-MC adenosin 5-difosfát (5 mol) o radioaktivítě 92,5 MBq v 5 m 1 50 ethylalkoholu byl vakuově odnpařen k suchu v »atmosféře N 2. K odparku se přidá směs ltohoto složenívždy čerstvý Mgclz 0,1 mol . l 1 100 l chlorid dnaselný KCl 1,0 In-ol . l 1 200 l chlorid amonný NH 4 Cl 0,05 mol . l 1 10 l redestilovanvä voda 380 lPotom se ke směsi přldá enzym polynukleotidfosforyláza v objemu 100 l. Enzymová reakce probihá 4 hodiny v termost-atu při teplwotě 317 °C. Po 4 hodinách se reakce ukončí a k reakčni směsi se přidá 1 ml roztoku chloroform isoamylalkohol v poměru 24 1. Vytřepávänim po dobu 20 minut a následnou centrifugaci 3000 ot. min 1,10 minut za» chlazení dojde k oddělení vrstev. Horní vodná vrstva obsahují-ci U-MC polyaldenylovou kyselinu, nezrewagovaný UMC adenosin Südífosfät a nižší radioaktivni oligonukleotidy se opatrně -odsaje. Objem roztoku byl 0,95 m 1, radioaktivitai 72,12 MBq. U-MC polyadenylová kyselina se od nízkomolekulárnich složek odděli chromato»gnafii na sloupci Sephadex-G 75, kolena 1,2 X 12 cm). Kolona se před delením okalibruje transperovou RNA počet nukleotidů cca 120, sedimentační k-onstanta 4 S .a nukleosid 5 «difosiá~tem. Elučnim roztokem je redestilrovaná voda. ímaji se frakce po 1 m 1. Frakce obsahující U~ 14 C polyadenylovou kyselinu byla v~ objemu 3 m 1. Celková ra~ dioaktlvita činila 28,84 MBq.fátu o specifické aktivitě 18,50 GBq . mmol se přidá směs tohoto složeníchlorid hořečnatý . vždy čerstvý chlorid draselný chlorid amonný redestilovaná vod-aPotom se ke směsi přidá enzym po 1 ynuk leotidfosioryiáza -v objemu 108 1. Enzymo- .vá reakce probíhá V termostatu při teplotě 37 °C po dobu 4 h-odin. Po 4 hodinách se k reakční směsi přidá směs Chloroformu a isoamylalkoholu v poměru 241 v objemu 1,018 ml a vytřepává se po dobu 20 minut. Po vytřepání následuje centrlfugacea ipři 3000 ot. min po dobu 10 minut, za chlazení. Horní vrstva obsahující 5-3 H) polyuridylovou kyselinu a další radioaktivní složky se opatrně ods-aje. Objem roztokučini 1 1,05 .m 1, radioaktività byla 52,2 MBq. izolace SŠH pvoiyuridylové kyseliny se provádí chromatografií na sloupci Sephapřed dělenim okalibruje triansferovou RNA počet nukleotidů cca 120, sedimentačni konstanta 43 a nukleosid Sľdifosfátem. Elučním roztokem je redesvtilovvaná voda, írnají se ľrakce po 1 ml. Celkový objem frakoe obsahující (5-3 H polyuridyl-ovou kyselinučin~i 1 3,0, radi-oaktívitzrroztoku byla 20,3 MBq~ 4 i1. Způsob enzymatickě přípľavy polyuukleotidů purmové a pyrimidinové řady zna« čených radioaktivním izotoąpem 140, resp. 3 H o molové aktivitě minimálně a 14 GBq .. mmol vyznačený tím, že se použije enzym, který je prostý cizor-odých bílkovtn,zejména nĺzkomolekulárních, čehož se do rsahuje jeho purífikací pomooíxafínitní chromatografie, s výhodou na poly/UjsepharoSB. mg-rg2. Způsobppodíle bodu 1 vyznačený tím, že stupeň polymerace v. průběhu enzymové Ireakce se zjišťuje detekcí radioaktivity složek reaíkční směsi.

MPK / Značky

MPK: C07H 19/048, C07H 19/16

Značky: enzymatické, purinové, pyrimidinové, izotopem, značených, radioaktivním, způsob, přípravy, resp, polynukleotidů, řady

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-259728-zpusob-enzymaticke-pripravy-polynukleotidu-purinove-a-pyrimidinove-rady-znacenych-radioaktivnim-izotopem-14c-resp-3h.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Způsob enzymatické přípravy polynukleotidů purinové a pyrimidinové řady značených radioaktivním izotopem 14C resp. 3H</a>

Podobne patenty