Způsob přípravy enzymové, resp. hybridní elektrody

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

rrr. PD P|S VYNÄLEZU 254645Řešení se týká připravy enzymové, resp. hybridni elektrody, jejíž podstata spočívá v tom, že se enzym nebo směs enzymů a/nebo celých buněk nebo jejích fragmentů, imobilisuje do kolagenové hmoty rozmíchánim v této hmotě s následným prokřiženim pomocí bifunkčních činidel a vytvořený kolagenový gel se fixuje na povrch elektrochemického sensoru například přetaženim a upevněním membrány propustné pro nizkomolekulární sloučeniny.Vynález se týka zpüsobu přípravy enzymové, resp. hybridní elektrody.Použití enzymu i celých biochemických systémů v analytické chemii znamená výrazný poknm především z hlediska vysoké substrátové a účinkové specifity enzymu a tím i probihajících reakcí, čímž je dána i vysoká selektivnost prováděných analýz. Reakce katalysované enzymy probíhají při velmi nízkých konoentracích substrátu s vysokou reakční rychlostí, aniž by vyžadovaly extrémní hodnoty teploty, tlaku pH reakění směsi. Z těchto důvodů je snížena na minimum možnost ovlivnění výsledku analýz tvorbou vedlejších produktů reakce, případně reakcemi jiných složek analyzovaně směsi látek.Použití volných enzymu naráží v některých případech na technické či ekenomické problémy jejich získávání, obtížnou regeneraci z reakční směsi, poměrně malou stabilitu volných enzymú atd. Tyto problémy jsou postupně řešeny náhradou rozpustných enzymů imobilizovanými enzymy použitelnými pro velký počet analýz.Výrazné uplatnění nalezly imobilizované enzymy ve formě enzymových elektrod. Enzymcvé elektrody jsou realisovány spojením imobilisovaného enzymu a vhodného elektrochemického aenzoru. Tímto způsobem je možno detegovat prüběh všech enzymových reakcí, při kterých dochází ke změně koncentrace elektrochemicky detegovatelných látek. velkou výhodou enzymových elektrod je rychlost, přesnost a reprodukovatelnost stanovení a dále možnost analýzy roztoků barevných, kapalných či fluoreskujících, kde jsou jiné způsoby detekce obtížné.Tato skutečnost umožňuje jejich použití v nejrůznějších oblastech chemie, chemické technologie,farmaceutického a potravinářského průmyslu, V moderních biotechnologiích a V klinickéAnalýtická využitelnost enzymových elektrod je podstatné ovlivněna jejich stabilitou. K hlavním faktorům, které ovlivñují stabilitu enzymových elektrod, patří způsob imobilisace,množství navázaného enzymu, Čistota enzymu, podmínky enzymové reakce a stabilita senzoru/elektrochemického čidla/. Z uvedených faktorů je způsob imobilisace nejsnáze ovlivnitelným faktorem, kterému je věnována náležitá pozornost.Vzhledem k tomu, že isolace některých enzymu je technicky či ekonomicky velmi náročná a dále s přihlednutím ke skutečnosti, že některé isolované enzymy jsou málo stabilní i v imobilisované formě, byla vyvinuta technika přípravy buněčných a hybridních elektrod.Tyto elektrody jsou připravovány za obdobných podmínek jako enzymové elektrodys tánxozdílan, že místo enzymu jsou na povrchu elektrochemického senzoru zachyceny celébunky, případně buñky společně s přidanými enzymy. Pro analytické účely se pak využívá analyticky významných enzymů, které jsou u použitých buněk v nadprodukci /a které jsoudíky fysiologiokému prostředí, v němž se nalézají, podstatně stabilnější než V isolovaném stavu/ nebo se analytickyvyužívá spřažených enzymových reakcí či celých komplexu metabolických pochodu, nejčastěji buněčné respirace.K přípravě buněčných nebo hybridních elektrod se běžně používají buñky mikrobiální,především kvasničné a bakteriální. Mohou být však použitý i isolované buñky živočíšne či rastlinné nebo různé subcelulární částice, jako např. mitochondrie.Z jednotlivých imobilizačních postupů se pro přípravu beněčných či hyhridních elektrod nejčastěji používá zabudování do gelu at již přírcdního /želatina, agar, algináty/ či synthetického /polyakrylamid/.Zpüsobem podle vynálezu je enzymová, resp. hybridní elektroda připravena imobilisací enzymu, buněk či jejich fragmentú, případně jejich směsi do kolaqenového gelu. Biologický,enzymově aktivní materiál se suspenduje v kolagenové hmotě, načaž se vytvořena hustá suspenze prokříží a zpevní pomocí bifunkčních čínídel (např. glutaraldehydu/. Vytvořený gel se poté fixuje na povrch elektrochemického sensoru a s výhodou se od reakčního prostoru oddělí membránou propustnou pro nízkomolekulární látky /např. celofánovou membránou/.Výhodou způsobu přípravy enzymové, resp. hybridní elektrody podle vynálezu je především jednoduchost způsobu imobilizace biologicky aktivního materiálu do kolagenové hmoty,kdy není nutná její předchozí aktivace a kdy je možno přímo imobilisovat jak samotné enzymy, tak i celé buñky či jejich fragmenty. Vytvořená tenká vrstva kolagenu, ve kterém je imobilisován enzymově aktivní materiál jednak vlastním zabudovánim do vytvořeně struktury kolagenového gelu a jednak následným prokřížením pomocí bifunkčních činidel, vytváří pro tento imobilisovaný materiál velmi příznivé podmínky z hlediska jeho stability. Enzymové,resp. hybridní elektrody připravené způsobem podle vynálezu jsou proto velmi stabilní.vynález je dokumentován příklady použití, aniž by se jimi omezoval P ř í k l a d 1Kolagenová hmota /1 g/ byla rozmíchána ve 2 ml 0,1 mol.dm 3 fosfátového pufru pH 5,8.Po krátkěm zahřátí /2 min/ na 40 OC, kdy došlo ke ztekucení, bylo aplikováno na celofánovou membránu o sile 30 m 20 l této hmoty, 0,2 mg lyofílizovaného preparátu glukosaoxidázya 2 l neředěného preparátu katalazy. Po promíchání vytvořené směsi bylo přidáno 5 l5 vodného roztoku glutaraldehydu a směs byla opět promíchána. Celofánová membrána s gelem byla přiložena na kyslíkové ćidlo Clarkova typu a pevně zafixována. Vytvořený kolagenový gel s imobilisovanými enzymy byl zachycen pod touto membránou, čímž byl zároveň chráněnpufru pH 5,8 při 4 °C. Časový interval mezi přípravou enzymové elektrody a prvním stanovenímpřed mechanickým poškozením. Celá elektroda byla uchovávána V 0,1 mol.dm její odezvy, resp. vlastním stanovením D-glukosy byl 24 hodin. P ř í k 1 a d 2Ke ztekucené kolagenové hmotě připravené podle příkladu 1 a nanesené na celofánovou membránu bylo přidáno 5 mg buněčných stěn kvasinek Saccharomyces cerevisiae s invertasovou aktivitou, 0 2 mg lyofilisovaného preparátu glukosaoxidasy a 2 l neŕeděného preparátu katalasy a mutarotasy. Po promichání vytvořené směsi bylo přidáno 5 l 5 vodného roztoku glutaraldehydu a směs byla opět promíchána. Celofánová membrána s gelem byla přiložena kolagenovou stranou na kyslíkové čidlo Clarkova typu a pevně zafixována. Celá elektroda byla uchovávána V 0,1 mol.dm 3 fosfátovém pufru pH 5,8 při 4 °C. Časový interval mezipřípravou enzymové elektrody a vlastním stanovením sacharosy byl 24 hodin.Ke ztekucené kolagenové hmotě připravené podle příkladu 1 a nanesené na celofánovou membránu bylo přidáno 10 mg vlhkých kvasinek Saccharomyces uvarum kultivovaných v mediu obsahujícím etanol. Po promichání vytvořené směsi bylo přidáno 5 l 5 vodného roztoku glutaraldehydu a směs byla opět promíchána. Celofánová membrána s gelem obsahujícím imobílisované buňky byla přiložena na kyslíkové čidlo Clarkova typu a pevně zafixována. Celá elektroda byla uchovávána v 0,1 mol.dm 3 fosfátovém pufru pH 5,8 při 4 °C. Časový interval mezi přípravou kvasničné elektrody a vlastním stanovením etanolu byl 24 hodin.1. Způsob přípravy enzymové, resp. hybridní elektrody vyznačující se tím, že se enzym či směs enzymú a/nebo celých buněk nebo jejich fragmentů imobilisuje do kolagenové hmoty jejich rozmícháním v této hmotě s následným prokřížením pomocí bifunkčních činidel, s výhodou pomocí glutaraldehydu, a vytvorený kolagenový gel s imobilisovaným enzymcvě aktivním biologickým materiálem se fixuje na povrch elektrochemického senzoru.2. Způsob podle bodu 1 vyznačujicí se tím, že se fixace kolagenového gelu 5 imobilisovaným enzymově aktivnim biologickým materiálem provede přetažením a upevněnĺm membrány prcpustné pro nízkomolekulárni sloučeniny.

MPK / Značky

MPK: C12N 11/04

Značky: způsob, hybridní, elektrody, enzymové, přípravy, resp

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-254645-zpusob-pripravy-enzymove-resp-hybridni-elektrody.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Způsob přípravy enzymové, resp. hybridní elektrody</a>

Podobne patenty