Způsob oddělování aminokyselin z peptidů a bílkovin

Číslo patentu: 252790

Dátum: 15.10.1987

Autori: Filka Karel, Fusek Martin, Turková Jaroslava

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

( ) Způsob oddělování aminokyselín z peptídů a bílkovinŘešení se týká oddělováni aminokyselin z peptidů a bilkovin z konce peptidového řetězce, obsahujícího volné karboxyluvé skupiny aminokyselín. Je určeno pro určení sekvence peptidů a bílkovin. Vodný roztok,pufrovaný na pH 5,0 až 8,0, obsahující peptidnebo bílkovinu, se podrobí působení enzymu karboxypeptidázy, imobilizovaném na poly-hydroxyethylmethakrylátovém gelu a to v ultrafiltrační cele opatřené membránou propouštějící pouze nízkomolekulární látky, jako aminokyseliny uvolněné karboxypeptidázou z peptidu nebo bílkoviny, za poměru enzym - substrát 1 ku 200 až l ku 2 U 00.Vynález se týká způsobu oddělování aminokyselín z peptidů e bilkovin z konce peptidového řetězce, obsahujícího volné karboxylové skupiny aminokyselín, pro určování sekvence peptidů a bílkovin.V biochemii je velice zepotřebí určovet primární struktury proteinů, to je sledu aminokyselín, jež vzájemné vázánypeptidickou vazbou vytvoří peptidy či proteiny. K tomuto postupu je využiváno známých způsobů, přičemž všechny jsou kompromisem mezi přesností stanovení e množstvím materiálu, jenž je nutno použít ke stanovení. Jeden známý způsob využívá specifických proteolytíckých enzymů, tak zvaných karboxypeptidáz. Tyto enzymy odštčpují jednotlivé aminokyseliny od toho konce peptidu čí proteínu, který má volnou karboxylovou skupinu.U dosud používaných tak zvaných klasických postupů určování koncových aminokyselín se jedná o zjištování obsahu jednotlivých aminokyselín V roztoku, který obsahuje zkoumený polypeptid a enzym, to je kerboxypeptidázu. Přitom prostředí, v němž je stanovení prováděno, je pufrováno na PH blizké optimu působení příslušné karboxypeptidázy.V původní reakční směsi, jež obsahuje s počátku pouze polypeptid a karboxypeptidázu, je sledována narůstející koncentrace aminokyselin, jež jsou přítomnou karboxypeptidázou uvolňovány z peptidu do roztoku.V daném klasickém postupu je krokem, jenž ovlivňuje přesnost způsobu, právě zpracování odebíraných podílů, určených k aminokyselinové analýze. V uvedeném klasickém postupu je ne 2252 790 výhodou nutnost srážení kyselinou tríchloroctovou, následná koncentrace precipítátu centrifugací, extrakce etherem a odpaření. Teprve po těchto operacích je vzorek připraven pro aminokyselinou analýzu.Uvedené nedostatky odstraňuje podle vynálezu způsob oddě~ lování aminokyselín z peptídů a bílkovín z konce peptidového řetězce pro určování sekvence peptidů a bílkovin, za použití enzymu kerboxypeptidázy, vyznačující se tím, že vodný roztok pufrovaný na pH 5,0 až 8,0, obsahující peptíd nebo bílkovínu,se podrobí působení enzymu karboxypeptidázy, imobilizovaném na poly-hydroxyethylmethakrylátovém gelu a to v ultrafiltrační cele opatřené membránou propouštějící pouze nízkomolekulární látky, jako aminokyseliny, uvolněné karboxypeptidâzou z peptidu nebo bílkoviny, za poměru enzym - substrát 1 ku 200 až l kuZákladní výhoda způsobu podle vynálezu spočívá v podstat~ ném zjednodušení postupu, nebot veškerá úprava vzorku před ami~ nokyselinou analýzou spočívá pouze V jeho odpeření. Další výhoda spočívá V tom, že karboxypeptídáza je imobílizovaná na pev~ něm nosiči a proto nedochází k její autolýze, dále je ji možno snadno oddělít ze směsi. Díky pevnosti použitého materiálu nehrozí nebezpečí jeho rozmělnění a karboxypeptidázu lze snadno opakované použít. Uvedený postup je proti klasickému způsobu sekvenování výrazně kratší, zhruba o polovinu a celý postup jeZpůsob podle vynálezu je dále blíže popsán na konkrétních příkladech provedeníPro použití kerboxypeptidázy Y k sekvenčním pracem byla karboxypeptídáza ímobilizována na poly-hydroxyethylmethokrylátovém gelu s imobílizovaným Konkavalínem A. Takto ímobilizovaná karboxypeptidáza byla přidána ke 3 ml roztoku proteínu /ribonukleáza A/. Koncentrece proteínu byla 10 mg v 3 ml 0,1 M acetátu sodného pH 6,0 s 0,5 laurylsírenu sodného. Roztok3 252 790 proteínu byl umístěn V malé ultrafiltrační cele /objem 10 ml/ s membránou propouštějící látky s molekulovou hmotnosti pod 2 000. Ve vhodné zvolených časových intervalech byl tlakem dusíku odebírán alikvot /0,2 ml/ a ten po odpaření byl přímo použit pro amínokyselinovou analýzu. Touto metodou byly získány výsledky o stejné kvalitě jako u klasického postupu.stejný postup s použitím ultrafiltrační cely byl využít pro sekvenční práci s karboxypeptidázou A a karboxypeptidázou B.Za podmínek uvedených V příkladu 1 bylo provedeno štěpení proteínu imobilizovanou karboxypeptídázou. 1 ml roztoku proteinu /0,1 M acetát sodný, pH 6,0 S 0,5 laurylsíranu sodného obsahující 2 g ríbonukleázy A/ byl podroben štěpení karboxypeptídázou Y imobilízovanou na polyhydroxyethylmethakrylátovém gelu s imobílízovaným konkanavalinem A. Bylo použito 200 ug nosiče s obsahem O,1,ug karboxypeptídázy Y. Byla použite ultrafiltrační cela 0 objemu 2 ml, apatřená membránou propouštějící látky s molekulovou hmotností pod 2 000 a odebírána vzorky o objemu 0,05 ml.Způsob oddělování aminokyselín z peptídů a bílkovin z konce peptidového řetězce pro určování sekvence peptidů a bílkovin,za použití enzymu karboxypeptídázy. vyznačuáící se tím že v°d hý roztok pufrovaný na pH 5,0 až 8,0, obsahující peptid nebo bilkovinu, se podrobí působení enzymu karboxypeptĺdázys ĺmobl lizovaném na poly-hydroxyethylmethakrylátovém gelu V ultrafíltrační cele opatřené membránou PV°P°uŠtěÚĺ°ĺ P°°Ze nĺZk°m° lekulární látky, jako aminokyseliny uvolněné karb 0 ŤyP 9 PtĺdáZ°u z pąppidu nebo bílkoviny, za poměru enzym - substrat 1 ku 200 až 1 Kü zíooq.Vytiskly Moravské tiskařské závody,střed. 11 1005 tŕ.Lidových milicí 3, Olomouc Cena 2,40 Kčs

MPK / Značky

MPK: C12N 11/08

Značky: způsob, oddělování, bílkovin, aminokyselin, peptidů

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-252790-zpusob-oddelovani-aminokyselin-z-peptidu-a-bilkovin.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Způsob oddělování aminokyselin z peptidů a bílkovin</a>

Podobne patenty