Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

s ÍÍ Š W it iuiexsxtuu GSVÉEDČEäIU süñAo PRO VYNÁLEZY 45 Vydané 15 08 35. 61 Autorské osvedčenie je závislé C 12 P 33 5 na tautorsiçom osvedčení č. 231 45854 Spôsob vprípravy derivátov ceľalosperínovVynáĺez Spüsob využitia imobíiizovaných iauniei pri príprave derivátov cefalosporínov buniek pri príprave derivátov cetalosport nov sa týka spôsobu enzýmovej prípravy derivátsv CSÍEIÍOSDDĽÍHOV CFS šíruktúrne ho vzorce II vitľ rovniea č. lt), ktoré sú nlčłdzĺpľůdlłlšľüľłlĺ pri príprave kyseliny 7 «Has (ř S,m a u e 235 o~ HN - w x àä R (CII 2)5 ~CO 1 ~§N i × ~r A s A x Hs O CH X 0 j CHQX s 2 z LJ p (UQH .m C 00 o) t( .,kde Enýzm Dwaminoacidoxidáza produkovaný x-O-CO-CH 3 bunkami Trigonopsis variabilis CCY 15-1-2 x~ 0 H je možne imobilizovat viacerými spôsobmi,x-»H pričom sa zvyšuje jeho stabilita a nekoľkoR-COOH násobne sa predlžuje použiteľnosť pri sú cefalosporin C CFS~C dezaoetyioefalosporíníc DCFS-C dezacetoxycefaiosporin C (DACFS-C-yaminocefaiosporänovej 7-ACK z látok štruktúrneho vzorca I pomocou imobilizov-aných buniek mikroorganizmov obsahujúcich D-aminoacid deaminujúcu-O 2-reduktázu .íD-aminoacidoxidázu, DAAO j.časnom zjednodušení technológie a možnomvyužití nových technologických postupov. Kyselinu Taminocetaiosporánovú je mož né pripraviť dvoma postupmi. Oba využívajúako substrát fermentačnou cestou získané cefalosporíny. Chemická konverzia je viacstupňový proces, náročný na čistotu používaných surovín a prísne dodržiavanie technologickýcłi operácií pri nízkych teplotách,pričom sa pracuje s toxickými látkami. Spôsob chemickej prípravy popisuje japonský patent č. 7 307117, patent NSR č. 1 445 615 ai., líšiace sa od seba spôsobom blokovanie karboxylovej a aminoskupíny a čs. A 0 193 181. V porovnaní s chemickým spôsobom je enzýmová konverzia výhodnejšie z hladiska menšej technologickej náročnosti, nie je požadovaný substrát vysokej čistoty a znižuje sa počet technologických operácií V procese. Enzýmavá konverzia je nenáročná na suroviny. jedná sa o jedno alebo dvojstupňovy proces, pričom V dvojstupňovej reakcii vznikajú z látok štruktúrnehao vzorca I latky štruktúrneho vzorca II, ktoré sú dostupným substrátom pre acylázy rôznych mikroorganizmov pri tvorbe 7-ACK. japonský patent č. 74 044 605 uvádza možnosť priamej enzýmovej konverzie cefalosporínov na 7-ACK vo fermentačnej pôde pôsobením Fusarium solani, japonský patent č. 55 35 119//1980 opisuje rovnaký produkčný kmeň. Patent NSR 2 723 463 sa zaoberá priamou konverziou CFS na 7-ACK pôsobením enzýmov z kmeňov Aspergillus a Alternaria rovnako ako US patent č. 3239 393 a japonský patent 53-94 093/1978, ktoré ako producentov uvádzajú kmene Brevibacterium, Achromobacter a Flavobacterittm.Výhodnejším spôsobom enzýmovej prípravy 7-ACK sa zatial javí dvojstupňový proces,V ktorom účinkom enzýmu DAAD na cefalosporíny štruktúrneho vzorca I dochádza ku oxidačnej deaminácii bočného reťazca v polohe 7 na caiemovom jadre za vzniku látok štruktúrnehr) vzorca II. japonský patent 54154 592/1979 popisuje použitie buniek Trigonopsis variabilis zaistenim glutaraidehydom, pričom dochádza ku zvýšeniu stability enzýmu a je možné použit biologický materiál viackrát. Japonský patent č. 5535118//1980 popisuje rovnakého kmeňa na konverziu s účinnosťou 95 0/0. ČS A 0 č. 221 003 popisuje sposob použitia aktivovaných buniek Trigąonopsis variabilis s účinnosťou 8085 percent. Aktivácia sa robí organickými rozpúšťadiami a detergentami. Brodelius V časopise Applĺed Biochem. Biotechnology 6/4//1981 str. 293 ~ 308 opisuje použitie buniek Trigonnopsis variabilis zabudovaných do alginätového gélu pri produkcii a-ketokyselín z D-aminokyselín. V prípade použitia buniek na konverziu vo filtráte z termentačnej pôdy, prípadne V eluáte, je doporučovaný prebytok enzýmu podľa japonského patentu č. 507 158. AO 231 458 opisuje metódy imobillzacie buniek mikroorganizmov za použitia polyfunkčný/ch činidiel.Vynález Spôsob využitia imobilizovaných buniek pri jiríprave derivátov cefaiosporínov využíva imobilizovane bunky kmeňa Trigonopsis variabilis CCY 1512 pripra 4vené modifikovaným postupom podľa čs. A 0 č. 231 458. Imobilizovaný biokatalyzátor katalyzuje Vznik derivátov cefalosporínov štruktúrneho vzorce II z látok štruktúrneho vzorca I. Látky štruktúrneho vzorca II sú medziproduktami pri príprave kyseliny 7-aInínocefalosporánovej. Substratom enzýmovej konverzie je vodný roztok sodnej soli ceíalosporínu C alebo depr-oteinizovaný filtrát fermentačnej pôdy alebo eluáty z II. purifikačného stupňa z puriiikacie CFS-ov o koncentrácii 3-5 0/0 hmotnostných. líoncentrácia imobilizovaiíeho biokatalyzátora pri reakcii je 10 ~ 15 0/0 hmotnostných a koncentrácia inhibítorov vedľajších reakcií je 0,1 až 0,5 0/0. Reakcia prebieha 28 hodín pri teplote 32-36 C za intenzívneho miešania a vzdušnenia.Biomasa produkčného kmeňa kvasinky Trigonopsis variabilis CCY 15-1-2 sa pripravuje dvojstupňovou kultiváciou, pričom každý stupeň trva 72 h pri 28 °C za vzdušnenia 1 1 objem živnej pôdy objem vzduchu za minútu). Do inokulačnej pôdy zloženia 2 kukuričného extraktu a 2 0/0 glukózy sa ako stimulátor tvorby enzýmu pridáva 0,3 0/0 D-valínu. pH pôdy pred sterilizáciou sa upraví na 5,0. Pre druhý stupeň fermentácie sa 810 0/0 inokula (TČkLljC fermentačná pôda zloženia. glukóza 3 0/0, peptón 1 0/0,kvasničný extrakt 1 0/0, KHPO 4 0,1 0/0, MgSOJ 0,09 0/0, ktora ako stimulátor obsahuje 0,25 percent D-metioniiíu. Biomasa z Íermentačnej pôdy sa získava centrifugäciou pri otáčkach 4000 min počas 30 min za chladenia Buuky po S-näsobnom premytí 0,lM tosfátovým tlmivým roztokom pH 7,5 sa deponujü pri -25 °C. Takto ošetrené bunky si zachovávajú enzýmovú aktivitu 10-12 mesiacov.Zosietene bunky Trigon-opsis variabilis sa pripravujú pôsobením polyaldehydických činidiel na bunkovú suspenziu o koncentrácii 10/0 polyaldehydu glutaraldehydu na bunkovú suspenziu so sušinou 10 0/0. Za stáleho miešania sa nechá pôsobiť 345 hodín pri laboratórnej teplote, pot-om sa centrifugácią-tx odseparuje biomasa, premyje sa vodou a deponuje pri -15 °C.Agregáty buniek s enzýmovou aktivitou sa pripravujú z premytej biomasy pôsobením zmesi 10/0 polyahlehydu glutaraldehyduj a 2 polyfunkčného činidla s obsahom amino- alebo iminoskupioy, napríklad polyetylénimín, tetrametyléndiamiií, SB-diaminodipropylamín ai. Táto zmes sa pripraví 24 hodín pred použitím a intenzívne sa mieša bez prístupu vzduchu. Po pridaní agregačnej zmesi k bunečnej biomase sa táto zhomogenizuje a vymrazuje sa 6-10 hodín pri 25 °C.Po rozmrazetií sa vzniknuté agregáty odseparujíi tiltraciou alebo centritugáciou,premyjâ a deponujú pri 4 °C vo fosfátovom tlmivom roztoku pH 7,5.Pri imobilizácii buniek na pevný nosič sa používajú jiorćzne aluminosililšátzvé mate 2 §š 1457riály, minerálne nosiče na báze kremeliny,porézneho skla, keramické materiály, hlinky, makroretikulárne živice ai. materiály s vysokou adsorpčnou schopnosťou. Naviazanie buniek sa robí bud adsorpciou za rastu,kedy sa do kultivačného média pridá 10 0/0 nosiča alebo naviazaním odseparovanej a premytej biomasy po ukončení fermentácie. V oboch prípadoch sa nosič s naviazanou biomasou premyje S-krát vodou a pôsobením horeuvedeiíej zmesi polyfukčných činidiel sa pripraví enzym-ovo aktívny imobilizovaný materiál. Na 5 g nosiča s adsorbovanou biomasou sa pridáva 30 m 1 zmesi polyfunkčných činidiel, vymrazí sa 4-6 hodín pri -25 °C, premyje sa a deponuje pri 4 °C v tlmivom roztoku pH 7,5. Enzýmavá aktívita u všetkých spomenutých spôsobov imobilizácie sa zachováva počas 10-12 mesiacov od prípravy.Pri enzýmovej konverzii sa vychádza z roztokov solí CFS-ov, deproteinizovaného filtrátu fermentačnej pôdy alebo z eluátov z purifikácie CFS-ov, pričom optimálna koncentrácia (JFS-ov, je 10 000 ~ 12 000 g//ml, optimum pH sa pohybuje od 7,9 do 8,1 a teploty od 33 do 35 °C. V prípade, že je v bunkách prítomná aj kataláza, je možné ju inaktivovat, pretože v opačnom prípade vznikajú produkty štruktürneho vzorca Il, kde R ~COCOOH, ktoré sú pre dalšie enzýmové spracovanie nevhodné. Na inhibiciu katalázy sa používajú anorganickě azidy azid sodný 0,1-0,5 , kyselina askorbovä, peroxid vodíka, zlúčeniny bóru metaboritan a perborát sodný ai. Reakcia vyžaduje aeróbne podmienky, optimálna aerácia je 1 iiter vzduchu na jeden liter reakčnej zmesi za minútu Doba reakcie je dva až šesť hohín. Orientačné sledovanie priebehu reakcie sa robí metódou tenkovrstvovej Chromatogratis na silikagélových platniach s UV 254 indikátorom, kvantitativne stanovenie sa robi vysokotlakovou chromatografiou.Enzýmovou konverziou vzniknuté látky štruktürneho vzorca II, kde R -COOH možmožno použiť ako substrát pre enzýmovú prípravu 7-ACK.Biomasa T. variabilis s aktívnou DAAD,získaná dvojsttlpňovou kultiváciou na pôde s obsahom metionínu (0,2 , bola odseparovaná. centrifugáciou pri otáčkach 4000..min 1 počas 30 minút, premytá vodou a deponovaná pri -25 °C. Po rozmrazení bola biomasa nariedená tak, aby sušina výslednej suspenzie bola približne 1 U 0/0. Bolo pridané 1 °/o glutardialdehydu a zmes bola miešaná 5 hodín pri laboratórnej teplote. Zosietené bunky boli odseparované Centrifugáciou, premyté a rozsuspendovane do tlmiveho roztoku pH 7,5 tak, aby sušina bola 10 . Na enzýmovú konverziu bola použitá takto pripravená suspenzia zosietených buniek v množstve 0,5 m 1 na 10 m 1 reakčnejzmesi obsahujúcej ako substrat sodnn sol CFS-C, v koncentrácii 12 D 00 Ing/ml a azid sodný 1 mg/ml. Reakcia prebiehala 2 hodiny pri 34 °C za intenzívneho vzdušnenia na trepacom stroji. Hodnota pH bola udržiavaná v rozmedzí 7,9-8,0. Stupeň konverzie bol 88 .Postup prípravy biomasy aj podmienky enzýmovej konverzie sú zhodné s príkladom 1,len na inhibicíu katalázy boli namiesto azidu sodného použité perboritan sodný NaBOH 2 O 2 . 314120 alebo perborát sodný NaBOs . 3 HzO.Stupeň konverzie bol 78 0/0.Postup je zhodný s príkladom l, pri enzýmovej konverzii boli namiesto sodnej soli CFS-C použité eluáty z purifikácie CFS-ov s koncentráciou 12 000 ,ąg/ml CFS-C. Stupeň konverzie bol 71 9/0..Biomasa produkčného kmeňa bola získaná postupom, opísaným v príklade 1. 24 trodín pred použitím bola pripravená reakčná agregačná zmes, obsahujúca 1 glutaraldehydu a 2 0/0 polyetyléniminu v destilova.nej vode a táto bola intenzívne miešané pri laboratórnej teplote bez prístupu vzduchu. Agregáty s enzýmovou aktivitou boli pripraľ vene pridaním tejto zmesi k biomase táto tvorila 25 reakčnej zmesi), ktorá bola po ciokladnom zhomogenizowaní vymrazená pri-25 C minimálne 8 hodín. Pôsobením činidiel vznikli z biomasy granulkovité alebo vločkovité agregáty, z ktorých po rozmrazení boli premývaním vodou odstránené zvyšky reakčnej zmesi, agregáty boli odseparovane centrifugaciou alebo odsatím a deponované v tlmivom roztoku pH 7,5 pri 4 °C. Na enzýmovú konverziu sa navažovalo 0,5 g agregátoxr na 10 ml reakčnej zmesi, obsahujúcej 10 000 - 12 000 g/ml sodnej soli CFS-C. Podmienky reakcií sú zhodné s podmienkami, uvedenými V príklade č. 1.Stupeň konverzie sa pohyboval V rozmedzí od 75 do 83 0/0.Postup je zhodný s príkladom č. 4, len na konverziu boli použité eluáty z purifikácie CFS-C s koncentráciou 12000 ,ug/mi CFS-C.Stupeň konverzie sa pohyboval V rozmedzí od 70 do 75 .Postup je zhodný s príkladom č. 4, ale 11 ainiesto polyetyléniminu bol pri príprave ag 251457regátov použitý tetrametyléndiamin. Stupeň konverzie bol 73 0/0.Postup ako V príklade č. 4, ale namiesto polyetyléniminu bol použitý diaminodipropylamín V rovnakej koncentrácii. Stupeň konverzie bol 75 0/0.Biomasa pripravená postupom, o-písaným v príklade 1, bola zriedená na sušinu 10 9/0. 15 m 1 biomasy bolo inkubovaných s 5 g alumínc silikátového nosiča s priemerom zŕn0,5 mm 3 hodiny. Nosič bol premytý vodou,bolo pridaných 3 U mi roztoku 1 glutaraldehydu vo vode a po 4 hodinovom vymrazovani pri -25 °C bol nosič premytý vodou. Na konverziu bolo použitých 5 g na 50 ml zmesi. Podmienky reakcie boli rovnaké ako v príklade č. 1. Stupeň konverzie bol 60 0/0.Biomasa bola kultivovaná V prítomnosti minerálneho nosiča, pridané-ho do pôdy pred sterilizáciou V množstve 5 0/0 na objem pôdy. Po ukončení fermentácie bol nosič s bunka~ mi preinytý a ďalší postup bol zhodný s príkladom č. 8. Stupeň konverzie bol 56 0/0.Spôsob prípravy derivátov cefalosporínov obecného vzorca lIkde -OCOCH.3, OH, -H R-CO 0 I vyznačujúci sa tým, že sa k vodnému roztoku sodnej soli cefalosporinu C o koncentrácii 3-5 hmotnostných alebo k eluátu z puritikácie ceialosporínuov o koncentrácii 3 až 5 0/0 hmotnostných pridávajú imobilizované bunky kvasinky Trigonopsis variabilisCCY 15-12 imobilizované modifik-ovanými postupmi podľa čs, A 0 č. 231458, pričom koncentrácia katalyzätora pri reakcii je 10 až 15 0/0 hmotnostných a koncentráciainhibítorov vedľajších reakcii 0,1-0,5 hmotnostnýcn a reakcia prebieha 2-8 hodin pri teplote 32-36 °C za intenzívneho miešania a. vzdušnenia a získané oefalosporínové deriváty štruktúrneho vzorca II sa izolujú.

MPK / Značky

MPK: C12P 35/06

Značky: derivátov, cefalosporínov, přípravy, spôsob

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-251457-sposob-pripravy-derivatov-cefalosporinov.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob prípravy derivátov cefalosporínov</a>

Podobne patenty