Kmen mikroorganismu Brevibacterium flavum CCM 3868

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

(54) Kmon mikroorganismu Brevibactarium flavum CCM 3868Účelem řešení je produkce esenciâlní aminokyseliny lysinu V medíu s melasou jako zdrojem uhlíku. Lysin syntetizuje a v mediu hromadí mutanta bakteriálniho druhu Brevibacterium flavum. Eůsobením mutagénu a aplikaci medií se zvyšujíoi se koncentraci melasy byla izolována mutanta rezístentnĺ k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu. dependentni na homoserin a leucin a rostoucí v mediu96 h v mediu s melasou jako zdrojem uhliku. hydrolyzátem àrnšidové mouky jako zdrojem dusíku a s minerálními solemi za aerobních podmínek při 28 °C a neutrálnim pH hroma díla V prostředí 46 g/1 L-lysinu. Lysin, využívaný především jako doplněk krmív,lze takto vyrábět s využitím mikroorganismů běžnýmí technologickými postupy.vynález se týká nového kmene mikroorganismu druhu Brevibacterium flavum, rezistentního k analogu lysinu a dependentního na homoserin a leucin, rostoucího v mediu s vysokým obsahom melasy a hromadiciho v mediu s melasou jako zdrojem uhliku a kyselým hydrolyzátem arašídové mouky a síranem amonným jako zdroji dusíku za aerobních podmínek a při neutrálnim pH vysoká množství lysinu.Vhodnýmí producenty lysinu, využivanýmí při jeho výrobě fermentačni cestou, jsouregulační mutanty koryneformnich bakterií, selektované jako mutanty rezistentni k analogům aminokyselín a dependentní zároveň na aminokyseliny. Takovými mutanty jsou např. mutanty Brevibacterium lactofermentum rezistentní k S-(2-aminoethyl)-L-cysteinu a dependentní na alanin nebo leucin a hromadici v glukosovém mediu 30-40 g/1 lysinu (Tosaka, 0.-Takinami, K.-Hirose,Y. Agr. Biol. Chem. 421 181, 1978 Tosaka, 0.-Eneí, H.-Hirose, Y. Trends in Eiotechnology 170, 1983).Při fermentačni přípravě lysinu s použitím melasy jako zdroje uhlíku lze použít mutanty druhu Brevibacterium flavum a Corynebacterium glutamicum, které kromě rezistence k anslogům aminokyselín a dependence na aminokyseliny byly ještě rezistentni k antibiotiküm, napł.k penicilinu nebo bacitracinu (US pat. 3 687 810, 1972 švýc. pat. 535 B 31, 1973). Produkce lysinu dosahované mutanty Brevibacterium flavum kolisaly v rozmezi 30-35 g/l.Produkci lysinu převyšuje dosud známé zminěné kmeny nový kmen Brevibacterium flavum,uložený v Československé sbirce mikroorganismů Univerzity J. E. Purkyně v Brně, třída Obránců míru 10, pod označením CCM 3 868, který je předmětem vynálezu.Hlavni výhodou nového kmene podle vynálezu je jeho schopnost růst v mediu s relativně vysokým obsahem melasy a v mediu s melasou jako zdrojem uhlíku produkovat lysin v relativně vysokých množstvich. Při kultivaci nového kmene v produkčnim mediu s melasou, kyselým hydrolyzátem arašídové mouky a siranem amonným jako zdroji dusíku a minerálnimi solemi v bañkách inkubovaných na rotační třepačoe při 28 °C a pH udržovaném vodným roztokem čpavku na pH 7,0 lze dosáhnout po 4 denni kultivaci produkce lysinu 46 g/l.Nový kmen Brevibacterium flavum CCM 3 S 68 je charakterizován následujicimi morfologickoGrampozitivní, nepohyblivé, nesporulující kokky až krátké tyčinky.Na masopeptonovém agaru tvoří okrouhlé, hladké, žluté kolonie s tovnými okraji.Na krevnim agaru tvoří okrouhlé, žluté kolonie s rovnými okraji, které nehemolyzuji. Při růstu V bujônu dochází k tvorbě zákalu a sedimentu, ne však blanky.Gluközu, fruktózu, sacharözu zkvašuje. Škrob hydrolyzuje jen slabě.Test na katalázu pozitivní. Voges-Proskauerův test negativni.K růstu vyžaduje z vitaminů biotin a thiamin, 2 aminokyselín homoserin a leucín. Je schopen růst v mediu se 60 melasy.Výchozi kmen, Brevibacterium flavum CCM 3 736, rezistentni k S-(2-aminoethyl)-L-cysceinua dependentní na homoserin a leucin, se submerzně kultivuje 24 h v kompletním mediu a buněčná suspenze po promytí fosfátovým pufrem (pH 7,2) se vystaví l 8 hod. působení 0,05 M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru (pH 7,2). Buněčná suspenze po aplikaci mutagenuse promyje sterilní destilovanou vodou a 5 (obj.) promyté suspenze se očkuji baňky s kompletním médiem, které se inkubují 24 h. 24 hod. kulturou se očkují baňky s mediem MeM, obsa~ hujícim 50 melasy, a to 1 8 (obj.) inokula.Po 4 dnech kultivace se kultura přeočkuje (opět použito 1 inokulab do baněk s mediem MeM se 60 8 melasy. Po 4 denní kultivaci se kultura vyočkuje na plotny s kompletním mediem. Kolonie vyrostlé po 2 dnech na plotnách se vyočkují na šikmé agary a izoláty vyrostlé na šikmých masopeptonových agarech se jednak testuji na stupeň rezistence k S-(2-aminoethy 1)-L-cysteinu a na dependenci na homoserin a leucin, jednak se zjištuje jejich schopnost produkovat lysin V mediu s melasou jako zdrojem uhlíku.Podrobnosti vynálezu vyplývají z následujících příkladů provedení priklad 1Mikroorganismem Brevibacteríum flavum CCM 3 736 se očkuje 60 ml kompletního media v somm varné bañce. složení kompletního media je následujícíroztok solí 1 ml/1 000 ml media agar (do tuhých medii) 2,5(Roztok solí je roztok 0,5 g FeS 04.7 H 20 a 0,5 g MnS 04.4 R 20 ve 100 ml vody.)Zaočkovaná baňka se inkubuje na rotační třepačce (frekvence otáček - 3,7, výstřednik 25 mm) 24 h při 28 °C. Buněčná suspenze se potom 2 x promyje fosfátovým pufrem (pH 7,2) a po promytí se vystaví lühod. působení 0,05 M roztoku ethylmethansulfonátu ve fosfátovém pufru(pH 7,2). Po aplikaci mutagenu se suspenze 2 x promyje sterilni destilovanou vodou a 5 (obj.) suspenze se očkuje 500 ml varná bañka se 60 ml kompletního media, která se ínkubuje 24 h při 23 OC na rotační třepačce. 1 (obj.) kultivačni tekutiny se očkuje 500 ml varná baňka 520 ml media MeM následujiciho složenímelasa 50,0 hydrolyzát arašídové mouky 2,0 močovina 0,5Zaočkovaná baňka se inkubuje 4 dny při 28 OC. 1 (obj.) kultivačni tekutiny se opět očkuje 500 ml varná bañka S 20 ml media MeM obsahujicího 60 Š melasy a buněčnou suspenzí po 4 denní inkubaci na rotační třepačce při 28 °C se po naředění očkují plotny s kompletním mediem. Plotny se inkubuji při 28 OC 2 dny a kolonie vyrostlé na plotnách se Vyočkuji na šikme agary s masopeptonovým mediem. vyrostlé izoláty se testují na stupeň rezistence k S-(2-aminoethy 1)~L-cysteinu, na dependenci na homoserin a leucin a na schopnost produkovat lysin v mediu s melasou jako zdrojem uhlíku.Kulturou kmene Brevibacterium flavum CCM 3 868, 24 h starou, se očkuje 60 ml inokulačniho media CSL-B-S v 500 ml varných bañkách. Stejným způsobem se naočkuje kontrola, tj. výchozĺ kmen Brevibacterium flavum CCM 3 735 složení inokulačního media je následujícíZaočkované banky se inkubuji na rotační třepačce (frekvence otáček - 3,7, výstřednik 25 mm) 24 h při 28 °c. 10 lobj.) inokula se očkuji 500 ml varné baňky s 20 ml produkčního media B-Me následujícího složenímelasa 30,0 S hydrolyzát arašidové mouky 15 (obj.)Během Adenní kultivace se pH upravuje ve Zdhod. intervalech vodným roztokem čpavku na hodnotu 7,0-7,2. Na konci kultivace se stanovi obsah lysinu a cukru V kultivační tekutině. Lysin se stanovuje manometricky s použitím dekarboxylázy lysinu a cukr jako glukóza 5 použitím analyzátoru glukózy Glucose Analyzer 2 (Beckman, U.s.A.).Produkce lysinu po 4 dnech kultivace činila 46 g/1 (produkce kontroly 30 g/1).Kmen mikroorganismu Brevibacterium flavum CCM 3 868, rezistentni k S-(2-aminoethy 1)-L-cysteinu, dependentni na homoserin a leucin, rostoucí V mediu s vysokým obsahem melasy a produkujlcí lysin V mediu s malnsou jako zdrojem uhlíku.

MPK / Značky

MPK: C12N 1/20

Značky: brevibacterium, flavum, mikroorganismu

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-246668-kmen-mikroorganismu-brevibacterium-flavum-ccm-3868.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Kmen mikroorganismu Brevibacterium flavum CCM 3868</a>

Podobne patenty