Kmen Streptomyces alboflavus CCM 3505

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Vynález se týká nového kmene Streptomyces alboflavus CCM 3505, který transformuje 5-hydroxy-anhydrotetracyklin na 6-deoxy-5-hydroxytetracyklin.

Text

Pozerať všetko

(54) Kmen Streptomyces alboflavus CCM 3505vynález se týká nového mene streptomycea alboflavua COM 3505. ktorý transfor muje S-hydrow-anłzydrotetracyklin na 6-deoxy-S-hydzfozytetracyklin.vynález se týká mene Streptowces alboflavus COM 3505, trensformuJícího 5-hydroxy-snhydrotetrncyklin ne ő-deoxy-S-hydroxytetracyklin (dowoykliu), při kultivsoi v tekutých živąých půdách obsahudících zdroje neimilovetelného uhlílcu, například sacharőzu nebo äkrob, zdroje esimilovatelnóho dusíku, například kukuřičnou máčecí vodu nebo mouku kukuřičnou,bevlníkovou či sojovou e minerální zime soli.Zmínämł kmen umožňuje výrobu tatracyklinovsho antibiotika doxycyklinu biologickou cestou. Dosud běžně klinicky užívená tetracyklinová antibiotika, tj. chlortetrecyklin,tetrncyklin a oxytetrscyklin, mají velmi široké uplatnění, přesto však mají některé vlastnosti, ktoré .jejich použití brzdí. Jde např. o vysrážení ve formě nerozpustná báze, čímž poklesno absorpce, nežádoucí působení na střevní mikroflőru apod. Naproti tomu doxycyklin se rychle a úplně absorbuje, vytvoří při nižších dávkách vysokou koncentraci v krvi, de asi třikrát účinnějši než dosud užívaná tatraoykliny.G-Deoxytetracyklirly se dosud vyrábědí chemickou cestou (C. R. Stephens se sp., J. Am. Ghem. Soc. 80, 5324. 1958 americký petentový spis č. 3 200 149) a to postupom, který .je náročný na suroviąy (drahé ketalyzátory), na přístrojové vybavení a na dodräoväní fyzikálních parametrů.Biologický postup má své přednosti i výhody pro svoji jednoduchost. Genetickou cestou se podařilo připravit kmen Streptomyces alboflevus, schopný transformovat ô-hydroszy-anłxydrotetracyklin na ő-deoxy-S-hydronąytatracyklin. Anhydrotetracykliny lze snadno získat z tetracyklinů působením silné minerální kyseliny, např. chlorovodíkové.Ve francouzském patentovém spisu č. 2 187 301 je popsáne. příprava kmene transformujícího armydŕotetracykliny. Jako hlavní a podstatný znak přípravy je uvedena dokonalá dehydratace kultury. Postup vedoucí k získání nového kmene podle vynálezu se liší rozdílným genetickým přístupem. Vychází ze znalosti bicsyntézy tetracyklinů, zvléště pak z posledních 3 až 4 fází (P. A. Miller se sp., Bioch. Bioph. Ras. Comm. 18, 325, 1965 americký patentový spis č. 3 433 709) a zaměřuje se na blokování poslední fáze, tj. biosyntézy oncytetracyklinu,připraven variant neprodukujících oiąytatracyklin (0 TC). Kmeny OTC jsou z genetického hlediska dvojího typu vzniklé bud zablokováním äaJia-dehydr-ogenázové aktivity a pak konečným produktom je 59,11 a-dehydro-ä-hydroxytetracyklin nebo zsblokováním hydroxylázová aktivity(týká se hydroxylace v pozici 6) a vzniká ő-deoxy-ñ-hydrontytetracyklin. Tudíž ne všechny OTC kmeny transformují dehydz-o-oxytetracyklin na ő-deoacy-S-hydrosqtetracyklin, ale Jen lnneny s poruěenou hydroxylázovou a zachovanou EaJTa-dehydrogenázovou aktivitou. Selekci nebo uutagsnním zásahom byly z kmenů OTC získány kmeny schopné transformace.Kmen Streptoxąyces alboflavus CGM 3505 byl připraven genetickými zásahy zaměřenými v prvá fázi na izolací kmenů OTC a ve druhá fázi pak na kmeny schopné transformace. Výchozím kmenem byl kmen Streptomyces alboflavus ATGC 15846. Pro všechny mutagenzxí pokusy byly připravovány suspenze spor suwtím kultury ze äikmáho sporulačního agaru sporulační půdy 10 ml sterilní destilovené vody a třikz-át promyty pufrem podle použitého mutagenu. Před použitím byle suepenze filtrována přes vatový filtr. Suepenze spor výchozího kmene pufru o pH 6 byla vystavena působení nitrosoetylmočoviny (NEU) v koncentraci 0,1 M po dobu 60 minut, po této době přežívelo řádově A 00 spor. V dalším pokusu byl kmen OTC vystaven působení lĺ-metyl-łl-nitro-l-nitrosogusnidinu v pufru o pH 8 a v koncentraci 0,01 M. Po 60 minutovém působení přežívelo řádovä 3.100 z spor. Izoláty z těchto pokusů byly vybírány podle toho, zde ztratily schopnost produkovst OTC, což se zdiätovelo screening testem. Z kolonií izolátů byly očkovány horní plošky válečků egarové sporuleční půdy a ty kultivovárąy v Petriho miekúch o průměru 100 mm. Misky Jednoho pokusu byly uloženy ve sklenených krabicích e nádobkou naplněnou vodou, aby nevysychely, s byly inkubovány 5 dnů při 28 °C. Poté byly pŕeneseny na testovací misky s kmenem Bacillus eubtilis 6633 citlivým na OTC. Po 18 hod. kultivece byly vybírány kmeny bez inlnibičních zőn, tj. kmeny orc.Ze Streptomyces alboflavus ATCC 15846 byl vybrán kmen OTC z POkUSů NEU, který se stal mateřským kmenem kmene Streptomyces alboflavus CCM 3505 podle vynálezu. Lpokusů byla výše uvedeným testom zjištěna frekvence reverzí 3,3 . Zbývající izoláty byly dále testovárxy screening testom podla schopnosti trnnafoz-movat 5-hydroxy-anłxydrotetracyklin na ő-deoxy-vS-hydroxytetracyklin tak, že byly čárově očkovány na Petriho misky vždy 1 kmen na 1 misku a po ädenní kultivaci při 28 °C bylo do vzdálenosti 10 mm od kultury umístěno malé množství 5-hydrory-anłnydrotetracyklinu. Po dalších 20 hodinách působení při 28 °C byly misky hodnoceny podle barvy záření v ultrafialovém světle 5-hydroąr-anhydrotetracyklin svítí citronově žluté, 6-deoxy-5-hydroxytetracyk 1 in oranžové žluté. Tímto testom byly vyloučeny kmeny ne-. transformujícfPosledním testem bylo sledování vlastní transformaoe kultivací na třepačce (3,83.S, výchylka 25 mm) při 26 až 38 °c, s výhodou při 28 °c, ve dvou stupních. Vegetativní inoku lum je kultivováno 30 hodin a jím v množství 3,3 obj. očkována produkční fáze. Ta je kultivována za týchž podmínek jako vegatetivní inokulum. Roztok 5-hydronqy-anhydrotetracyklinuvo směsi dimetylformamidu s vodou (11), v koncentraci 5 až 12 g/litr lze přidat na začátku kultivece, výhodnější je však přídavek v době dobře narostlé kultury. Kultivece končí kolem 120. hod. Přítomnost 6-deo 1 cy-5-hydro 1 qtetracyklinu se testuje papír-dvou chromatografiínebo chz-omatografíí na tenké vrstve v systému kyselina citronová - n-butanol - chloroform.Výsledky chromatograťie se potvrzují autobiografií, tj. přenesením chromatogramů jednotu vých kmenů na misky s testovacím kmenem Bacillus subtilis 6633, tedy biologickou účinnosti. Kmen Streptomyces alboflavus CCM.3505 byl připraven působením N-metyl-DI-nitroąN-nitrosoguanidinu na výše uvedený msteřský kmen.Kmen Streptomyces alboflavus COM 3505 podle vynálezu se neliší morfologicky od výchozího kmene, je však odlišný svými fyziologickými vlastnostmi, které jsou projevem genetických změn jde o neschopnost biosyntetizovat oaąytetracyklin e o schopnost transformovat 5Nový lonen Streptomyces alhoflavus byl uložen v Československé sbírce mikroorganismů Univerzity J. E. Purkyně v Brně, Tř. Obránců míru 10, pod číslem COM 3505.V následujícím příkledu provedení je ilustrovâxua kultívace nového kmene a provedení transformace 5-hydroxy-anhydrotetracyklinu na 6-deoxy-5-hydroxytetracyk 1 in.Kulturou kmene Streptomyces alboflavus COM 3505 vyrostlou na šikmém agaru sporulační půdy XVI se lcličkou spor očkuje 30 m) živné pñdy ve varné haňce o objemu 500 ml.pH upravit pomocí NaOH (20 roztok) na 7,3, sterilizace 30 minut při 120 °C.složení půdy pro připravu vagotativniho inokulakukuřičná máčeci voda 1,0 hm. aacharőza 1,5 hydroganfoaforečnan amonný 0,2 dihydrogenfoaforečnan draaelny 0,2 airan hořačnatý kryatalioký 0,025 vodovodní voda do 100,0pH před sterilizaci 6,6, po sterilizaci (30 minut. při 120 °C) asi 6,3. Kultivaco na rotační třepačce (3,e 3.s, výchylka 25 m) při 25 °c trvá 30 hodin.Získaným vegetativnim inokulom v množství 3,3 aš obj. očkuje 30 m 1 produkčni püdy va varných baňkách o objemu 500 m 1 tohoto složeníkukuřičná máčecí voda 3,0 5 hm. aacharőza 1 ,25 chlorid vápenatý 0,95 hydrogenfoaforačnan amonny 0,26 vodovodni voda do 100,0pH před atarilizací 6,3, po sterilizaci (30 minut při 120 °G) asi 6,7.Po naočlcování se kultivuje na rotační třepačce 0,834 , výchylka 25 mm) při 28 °G,za 72 hodin ae přidá 1,2 ml roztoku anhydroonrytetracyklinu vo směsi dimetylfomamid - voda(11) obsahujícího 250 mg anhydrooxytetmcyknnu v 1 m 1. Po 48 hodinách se stanovi přitomnost 6-deoxy-5-hydrozqtetracyklinu papírovou chromatografii a .jeho biologická účinnost autobi ografii .Antibiotikum aa přivade do formentačni kapaliny okyaelenłm na pH 1. Z Čiráho filtratu se izoluje z kyselého prostředí ,jako aůl a aromatickou aulfolqaelinou nebo při neutrálnímpH ,jako komplex ae zinkem nebo vápnikem a hořčikem. Tyto aloučoniw ao pak přovodou na hydrochlorid. Celkový výtlžol operace Ja 50 až 55 S.Kmen Stroptowcoc alboflavua CGI 3505, trannformudici ä-hydroąy-anhydrotetracyklin nn ö-deow-ř-łnydroxytetracyklin.

MPK / Značky

Značky: alboflavus, streptomyces

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-217931-kmen-streptomyces-alboflavus-ccm-3505.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Kmen Streptomyces alboflavus CCM 3505</a>

Podobne patenty