Kmen Streptomyces rimosus CCM 3506

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Vynález se týká nového kmene Streptomyces alboflavus CCM 3506, který transformuje 5-hydroxy-antydrotetracyklin na 6-deoxy- 5-hydroxytetracyklin.

Text

Pozerať všetko

(40) Zveřejnêno 23 05 32 a mwmmz (45) Vydáno 15 12 34 AODIEVY 1730 v ná PALEČKOVÁ mnnšm dr., vonnmíćxcovs .mm dr., šum( KAREL dr.,7 vonnaáčm( mlwsmv dr., mm(54) Kmen Streptomyces rimosus CGM 3506vynález sa týká nového kmene streptomycea rimosus CCM 3506, který trenaformu.je S-łwdroąq-anhydrotetracyklin na G-deogy-5-hydroqtetracyk 11 n.vynález se týka kmene Streptonwces rimosus COM 3506, transformujícího ä-hydroaq-anhydrotetrecyklin n ő-deoq-ä-hydroxytetracyklin (dozycyklin), při kultivaci v tekutých živąých půdách, obsahujících zdroje asimilovatelného uhlíku, např. saohsrőzu nebo äkrob,zdroje esimilovateiného dusíku, napr. kukuřičnou máčecí vodu nebo mcuku kukuřičnou, baviníkovou či sojovou a minerální živné soli. iZmíněny kmen umožňuje výrobu tetracyklinového antibiotika doxycyklinu biologickou cestou. Dosud běžně kliniclw užívená tetracyklinová antibiotika, tj. chlortetrscyklin, tatracyklin s oxytetracyklin, mají velmi iroké uplatnění, přesto vše) mají některé vlastnosti,ktoré jejich použití brzdí. Jde např. o vysrážení ve formě nerozpustně báze, čímž poklesne sbsorpce, nežúdoucí působení na střevní mikrofloru opod. Naproti tomu doxycyklin se rychle a úplně absorbuje, vytvorí při nižších dávkách vysokou koncentrsoi v krvi, je asi trikrát vičinnäjäí než dosud užívanó tetrsoykliny.ő-deoxy-tetracykliny se dosud vyrábějí chemickou cestou (C. R. Stephens se sp., J. Am. Ghem. Soc. 80. 5324, 1958 omericld pstentový spis č. 3 200 149), a to postupem, ktorý je náročný na suroviny (drahé katalyzatory), na přístrojové vybavení a na dodržování fyzikálních parametrů.Biologický postup má své prednosti i výhody pro svoji jednoduohost. Genetickou cestou u podařilo připravit kmen Streptonwces rimosus, schopný transformovat ä-hydronąy-anłrydrotetracyklin na G-deoxy-S-hydroxytetracyklin. Anhydrotetracykliny lze snadno získat působením silná minerální kyseliny, například chlorovodíkové, z tetrscyklinů.Vefrancouzském patentovám spisu č. 2 187 301 je popséna příprava kmene Streptomyces elboflevus e lusitenus transformující anhydrototrscykliny. Jako hlavní a podstatný znak prípravy je uvedena dokonalá dehydratace kultury.Postup vedoucí k získání nového kmene podle vynálezu se liší rozdílným genetíckým přístupem. Vychází ze znalosti biosyntázy tetracyklinu, zvláště pak z posledních dvou až čtyřech fází (P. A. Miller a sp. Bioch. Bioph. Res. comm. 18, 325, 1965 americký patentový spis č. 3 433 709) a zeměřuje se na blokování poslední fáze, tj. biosyntézy oxytetracyklinu, prípravou variant neprodukujících oxytetracyklin (OTC). Kmeny OTC jsou z hlediska genetického dvojího typu vzniklé bud zablokováním 5 a,1 ia-dehydrogenázové aktivity a pak konečným produktom je 5 s,1 ia-dehydro-ñ-hydroxytetracyklin nebo zablokováním hydrolázové aktivity (týká se hydroxylace v pozici 6) a vznika 6-deoxy-S-hydroxytetracyklin. Tudíž ne všechny OTC kmeny transformuji enhydrooxytetracyklin na ő-deoxy-S-hydroxytetracyklin, ale jen meny s poruienou hydrozylázovou a zachovanou Äąlia-dehydrogenázovou aktivitou. Selekcí nebo mutagenním zasehem byly z kmenů OTC získány kmeny schopné transformace.Kmen Streptomyces rimosus CCM 3506 byl připraven genetickými zásahy zsměřenými v prvé fázi na izolací kmenů OTC a ve druhe fazi pak na kmeny schopné transformace. Výchozím kmenem byl kmen Streptomyces rimoeue ATCC 10970. Pro mutagenní pokusy byly připravovány suspenze spor smytím kultury ze äikmého agaru spolurační pddy 10 ml sterilni dsstilované vody a třikrát pronwty destilovenou vodou. Před použitím byla suspenze filtrována přes vatový filtr. 7 ml suspsnze spor v Petriho misce o průměru 70 mm bylo ozsřováno ze vzdálenosti 200 mm germinidní lampou Phillips TUV 40 W po dobu 30 s. Během pokusu byla suspenze michana elektromagnetickým míchadlem. V pokusech přežívslo 1.104 5 spor. Izoláty z těchto pokusů byly vybírány podle toho, zda ztrstily schopnost produkovat OTC, což se zjištovało scraening testom. Z kolonií izolatü byly očkovany horní ploěky válečků egarové spomlační půdy a ty kultivovány v Petriho miskach o průměru 100 mm. Misky jednoho pokusu byly uloženy ve sklenených krabicich s nádobkou s vodou, aby nevysychsly, a byly inkubovány 5 dnů při 28 °C. Potě byly pŕeneseny na testovací, misky s kmenem Bacillus subtilis 6633 citlivým na OTC. Po 18 hodinách kultivace byly vybírány kmeny bez inhibičních zon, tj. meny OTCŽPro kmen Streptomyceo rimosus ATCC 10970 bylo použito jako mutagenu pouze üv-záření. Z pokusů byl zztskán kmen OTC, který se stal mateřským kmenem kmene Streptomyces rimosus COM 3506 podle vynálezu. Z pokusů výše uvedeným testom byla zjištěne frekvence reverzí |,5 . Zbývající izoláty byly dále testovány screening testem pod 1.e schopnosti trensformovat 5-hydroxy-anłxydro-totrecyklin na 6 vdeoxy-ä-hydroxytetraoyklin tak, že byly čárově očkovány na Petriho misky vždy jeden onen na Jednu misku e po ädenní kultivaci při 28 °C bylo do vzdálenosti 10 mm od kultury umístěno malé množství ä-hydroxy-ertłwdrotetracyklinu. Po delších 20 hodinách působení při 28 °C byly misky hodnoceny podle barvy záření v ultrafielovém světle řkgydrouw-ąnhydrotetracyklin svítí citronově žluté, ô-deoxy-ä-hydroxytetracyklin oranžové zlaté. Tímto testem byly vyloučeny meny netreneformující.Posledním testom bylo sledování vlastní transformece kultivecí na třepačce (333.54,výchylke 25 mm) při 26 až 38 °C, výhodné při 28 °C, ve dvou stupních. Vegetativní inokulum je kultivováno 30 hodin a jim v množství 3,3 obj. očkována pŕodukční fáze. Ta ,jn kultivována za týchž podmínek jako vegetativní inokulum. Roztok 5-hydroncy-ar 1 łxydrotetrecyklinu ve směsi. dimetylfozjąnamidu e vodou (11), v koncentraci 5 až 12 g/l lze přidat na začátku kultivace, výhodnějäí je však přídevek v době dobře nerostlé kultury. Kultivece končí kolem 120. hodiny. Přítomnost ő-deom-ő-hydroxytetrecyklinu se testuje papirovou chromatografíí nebo chrometogrefií ne tenké vrstvě, v systému kyselina citrónová - n-butenol - chlorofom. Výsledky Chromatografia se potvrzují eutobiogrefíí, tj. přenesením chromatogremů jednotlivých lnnenů na misky s testovaciu kmenem Bacillus subtilis 6633, tedy biologickou účinnosti. Kmen Streptomyces rimosus UCM 3506 podle vynálezu se nelíši morfologicky od výchozího kmene, Je však odlišný svými fyziologickýmí vlastnostmi, které jsou projevem genetických změn jde o neschopnosť. biosyntetizovet oxytetracyklín a o schopnost transformovet Emydroxyanhydrotetraoyklin na ő-deonq-ä-hydrozcytetrecyklin.Novy kmen Streptomyces rimosus byl uložen v československá sbírce mikroorganismů Uníverzity J. E. Purkyně v Brně, Tř. Obránců míru 10, pod č. COM 3506.V následujícím pŕíkledu provedení je ílustrovâne kultivace nového kmene a provedení trensformace ä-hydroxyanhydrotetracyklinu na ômdeoxy-B-łxydroaąr-tetracyklin.Kulturou kmene Streptomyces rimosus CCM 3506 vyrostlou na šikmém egaru sporulačni pů~ dy Medium 196 Difco so kličkou spor očkuąe 30 m 1 živné půdy ve varné baňce o objemu 500 ml.foto půda má složeníkukuřičná máčec-.í voda 1,0 hm. sacherőza 1 ,5 hydrogenfosforečnen emormý 0,2 dihydrogenfosforečnan draselný 0,2 síren hořečnatý kryatalický 0,025 vodovodní vode do 100,0pH před uterilizací 6,6, po eterilizaci (30 minut při 20 °C) asi 6,3. KulT-ivece n rotační třepečce (3,e 3.s, výchylka 25 mm) při za °c trvá 30 hodin.Získaným vegetativním inokulem se množství 3,3 obj. očkuje 30 m 1 produkční půdy ve ver-nych bankách o objemu 500 m 1 tohoto složeníkukuřičná máčecí vode 3,0 5 hm. aecharóza 1 ,25 chloriú vápenatý 0,95 hydrogenfosforečnen amonný 0,26 vodovodní vode do 100,0pH před sterilizaci 6,6, po sterilizeci (30 minut při i 20 °C) asi 6,7.Po naočkování se kultivuje na rotační třepačce(3,83.s 1 Výchľlka 25 mll) Při 25 °C,za 72 hodin se pŕidá 1,2 m 1 roztoku anhydrooxytetracyklinu va směsi dimotylformnmid - voda(1 z 1), obaahujíciho 250 mg anhydroowtetracyklinu v 1 m 1. Po 48 hodinách se stanoví přítomnost G-deoxy-S-hydroacytetrncyklinu papírovou chromatogrsfií a jeho biologická účinnost nutohiografií .Antibiotikum se převede do fermontační kapaliny olqselením na pH 1. Z čirćho filtrátu se izoluje z kyseldho prostředí .jako aůl s aromatickou aulfokyselinou nebo při neutrálnímpH Jako komplex se zinkem nebo vápníkem a hoŕčíkem. Tyto sloučeniny u pak převedou na hydrochlorid. Celkový výtěžek operace je 50 až 55 âí. «Kmen Streptomyces rimosus CGM 3506 transfomující ä-hydrozy-anhydrotetracyklin na 6-deoąv-B-łwdroxytetracyklin.

MPK / Značky

Značky: streptomyces, rimosus

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/4-217930-kmen-streptomyces-rimosus-ccm-3506.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Kmen Streptomyces rimosus CCM 3506</a>

Podobne patenty