Spôsoby a kompozície na charakterizáciu enzýmu systému redoxných činidiel

Číslo patentu: E 5113

Dátum: 29.06.2005

Autori: Hartz Thomas, Byrd Patricia, Qian Suyue

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Spôsoby a kompozicie na charakterizáciu enzýmu systému redoxných činidiel0001 Detekcia analytu vo fyziologických tekutinách alebo vzorkoch, napr. krvi alebo krvných produktov, má vdnešnej spoločnosti stále rastúcu dôležitosť. Testy na detekciu analytov nachádzajú použitie vcelom rade aplikácií, vrátane klinického Iaboratórneho testovania, domáceho testovania, apod., ked výsledky takého testovania majú významnú úlohu pri diagnóze a zvládaniu velkého množstva chorobných stavov. Požadované analyty zahrnujú glukózu na zvládanie diabetu,cholesterol apod. Ako odpoved na tento rastúci význam detekcie analytov bol vyvinutý celý rad protokolov a zariadení na detekciu analytov ako pre klinické tak pre0002 Jedným typom metódy, ktorá sa používa na detekciu analytov, jeelektrochemická metóda. V týchto metódach je vzorka vo vodnej kvapaline vloženádo reakčnej zóny v elektrochemickom článku obsahujúcom aspoň dve elektródy, t.j. referenčnú a pracovnú elektródu. Zložka, ktorá má byť analyzovaná, je ponechaná reagovať priamo selektródou alebo priamo či nepriamo sredoxným činidlom za vzniku oxidovateľnej (alebo redukovatelnej) látky vmnožstve zodpovedajúcom koncentrácii zložky, ktorá má byť analyzovaná, t.j. analytu. Množstvo prítomnej oxidovateľnej (alebo redukovatelnej) látky je potom stanovené elektrochemicky avztiahnuté k množstvu analytu pritomnému vo východzej vzorke.0003 Pri mnohých takých elektrochemických postupoch detekcie analytu je použitý systém produkujúci signál oxidácie analytu, tento systém obsahuje enzýmovú zložku a mediátorovú zložku, kde enzýmová zložka oxiduje požadovaný analyt a potom prenáša elektrón na mediátor, ktorý ďalej prenáša elektrón na elektródu velektrochemickom článku, a tým vzniká elektrický signál, zktorého môže byť0004 Pri navrhovaní elektrochemických testov a systémov detekcie analytov je žiadúce používať enzým špecifický pre analyt. Napríklad čo sa týka stanovenia glukózy, jedným enzýmom, ktorý môže byt použitý v systéme produkujúcom signál oxidujúci glukózu, je rozpustná forma pyrrolochinolín chinón (PQCU-dependentnej glukózodehydrogenázy (ďalej v tomto texte nazývaná s-GDH). s-GDH je zlý príjemca elektrónov, a je teda prospešné, že nie je citlivá k prítomnosti kyslíka vo vzorcoch0005 Predsa len nevýhodou prirodzene sa vyskytujúca s-GDH alebo s-GDH divokého typu je to, že oxiduje nie len glukózu, ale aj iné redukujúce sacharidy vrátane maltózy, galaktózy, Iaktózy, mannózy, xylózy a ríbózy. Reaktivíta s-GDH so sacharidmi inými než glukózou môže v určitých prípadoch zhoršiť presnosť stanovenia hladín glykémie u niektorých pacientov s diabetom. Napríklad pacienti na peritoneálnej dialýze liečení icodextrinom (polymér glukózy) môžu mat v krvi vysoké0006 Tento nedostatok špecificíty s-GDH viedol k snahe zlepšiť špecificitu s-GDH tvorbou mutantných foriem enzýmu, napr. kde bola vytvorená jedna alebo viac substitúcií aminokyselín. Predsa len predtým, než také zmenené enzýmy môžu byt použité, musia byt testované, aby sa stanovila ich vhodnost na použitie v detekčných0007 Aj keď boli na stanovenie aktivity s-GDH použité časovo náročné spektrofotometrické testy, sú ale používané iba vpodmienkach slimitujúcim enzýmom. V patente USA 6 103 509 a európskej patentovej prihláške č. EP 1 176 202 A 1 je opísaný spektrofotometrický test spoužitím 2,ô-dichlórfenolindofenolu0008 Avšak typické komerčné glukózové testovacie prúžky používajúce s-GDH neužívajú podmienky s limitujúcim enzýmom, pretože enzým je prítomný v nadbytku,aby sa zaistila dlhodobá účinnosť prúžka. Rekombinantné proteíny, napríklad mutantné formy s-GDH, sú obvykle produkované iba v malých množstvách. Testovanie reaktivity týchto mutantných foriem s-GDH zahrnuje výrobu enzýmom potiahnutých prúžkov a testovanie každej šarže prúžkov plnou krvou alebo plazmouobohatenou glukózou a každým možným interferujúcim (t.j. redukujúcim) sacharidomv rozmanitých koncentráciách. Produkcia testovacích prúžkov potiahnutých s každou mutantnou formou s-GDH vyžaduje velké množstvo každej mutanty, je náročná na čas a prácu a vyžaduje, aby laboranti testovali prúžky s ľudskou krvoualebo plazmou, čo predstavuje možné biologické riziko.0009 Preto je teda potrebný rýchly a lacný test, ktorý je obmedzený substrátom, na určenie, či je zaručená hromadná produkcia konkrétneho mutantného enzýmu, napr. s-GDH, v dôsledku jeho zlepšenej glukózovej špecificity oproti divokému typu s-GDH. Test by mal byť tiež použiteľný pre vzorky neobsahujúce krv obohatené glukózou alebo interferujúcimi sacharidmi namiesto vzoriek plnej krvi alebo plazmy obohazených redukujúcimi sacharidmi. V obore je teda ďalej potrebný spôsob, ktorý je rýchly a jednoduchý na použitie pri určovanie sacharidovej špeciñcity mutantných foriem s-GDH, ktorý používa malé množstvo enzýmu a ktorý modeluje podmienky slimitujúcim substrátom na typických testovacích prúžkoch na meranie analytu(napr. glukózy) na elektrochemickom základe vo vzorke tekutiny (napr. plnej krvi alebo plazmy). Okrem toho je tiež požadovaný rýchly a jednoduchý spôsob merania0010 Patentové dokumenty USA 5 484 708 5 723 284 5 834 224 5 942 102 5 912199 5 997 817 6 059 946 6 083 710 6103 509 6121009 6134 461 6179 979 6193 973 6 231531 6 284125 6 340 428 6 444115 a 6 716 577 a tiež ďalšie patentové dokumenty US 2003/0104595 WO 99/49307 WO 97/18465 WO 01/57510 W 0 01/57238 WO 02/48707 W 0 02/50609 WO 02/06788 EP 0969097 EP 1176202 JP 091403378 A a GB 2 304 628.0011 Sú poskytnuté spôsoby a kompozicie na charakterizáciu enzýmu systému redoxných činidiel. V praxi predkladaného spôsobu je vzorka, ktorá obsahuje enzým systému redoxných činidiel a známe množstvo substrátu, aplikovaný na elektrochemický článok, ktorý obsahuje kompozíciu činidiel bez enzýmu majúci mediátor systému redoxných činidiel. Sú tiež poskytnuté elektrochemické testovacieprúžky, ktoré zahrnujú predkladané elektrochemické články, a systémy a súpravy, 4ktoré zahrnujú to isté. Predkládaný vynález nachádza použitie v celom rade rôznych aplikácií, vrátane aplikácií s charakterizáciou systému redoxných činidiel.0012 Lepšie porozumenie vlastnostiam a výhodám predkladaného vynálezu sa dosiahne z nasledujúceho podrobného opisu, ktorý uvádza názorne uskutočnenia, vktorých sú použité princípy vynálezu, a sprievodné obrázky, v ktorýchObr. 1 je vývojový diagram ilustrujúci poradie krokov v spôsobe podľa prikladnéhouskutočnenia predkladaného vynálezu na testovanie mutantnej formy s-GDHObr. 2 A a 2 B je schematický pohľad a pohľad zhora, V danom poradí, na testovací prúžok, ako môže byť použitý v príkladných spôsoboch podľa predkladanéhoObr. 3 je vývojový diagram ilustrujúci poradie krokov v spôsobe podľa príkladného uskutočnenia predkladaného vynálezu na meranie aktivity s-GDH divokého typu a jejObr. 4 je graf ukazujúci absolútny sklon s-GDH divokého typu a dvoch mutantných foriem s-GDH (Asn 452 Thr a Asp 167 Glu) ku kontrole neobsahujúce žiadne interferujúce sacharidy ako funkciu koncentrácie xylózy spoužitim obvykiéhoenzýmom potiahnutého testovacieho prúžkaObr. 5 je graf ukazujúcu reakciu ako funkciu koncentrácie sacharidu pre obvyklýenzýmom potiahnutý testovací prúžok, V ktorom enzým je s-GDH divokého typuObr. 6 je graf ukazujúci reakciu ako funkciu koncentrácie sacharidu spoužitims-GDH divokého typu v spôsobe podľa predkladaného vynálezuObr. 7 je graf ukazujúci reakciu ako funkciu koncentrácie sacharidu spoužitimmutantnej formy s-GDH, Asn 452 Thr, v spôsobe podľa predkladaného vynálezuObr. 8 je graf ukazujúci reakciu ako funkciu koncentrácie sacharidu s použitím ďalšejmutantnej formy s-GDH, Asp 167 Glu, v spôsobe podľa predkladaného vynálezuObr. 9 je graf ukazujúci kalibračnú krivku pro s-GDH divokého typu získanúv spôsobe podľa predkladaného vynálezu

MPK / Značky

MPK: C12Q 1/00, G01N 33/543, G01N 33/558

Značky: charakterizáciu, systému, redoxných, kompozície, enzymů, spôsoby, činidiel

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/38-e5113-sposoby-a-kompozicie-na-charakterizaciu-enzymu-systemu-redoxnych-cinidiel.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsoby a kompozície na charakterizáciu enzýmu systému redoxných činidiel</a>

Podobne patenty