Spôsob imobilizácie buniek na živici

Číslo patentu: E 7220

Dátum: 15.03.2006

Autori: Monciardini Simone, Zuffi Gabriele

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Spôsob imobilizácie buniek na živici Opis Oblast málezu0001 Predložený vynález sa zaoberá spôsobom imobilizácie buniek apoužívaním živíc na0002 Imobilizácia buniek je už niekoľko desaťročí dobre známou technikou používanou na zlepšenie fermentačných abíosyntetických procesov. Najbežnejšie používané techniky na imobilizáciu buniek sú zavádzanie kovalentných väzieb medzi bunkami aaktivovaným anorganickým nosičom, ako je napríklad silanizovanýz oxid kremičitý alebo oxid kremíčitý upravený s glutaraldehydom a izokyanátom 3, alebo zosíeťovanie medzi bunkami bi- alebo polyfunkčnými činidlami, ako je napr. glutaraldehydą a toluéndiizokyanát, alebo zachytenie do polymérovej matrice, ako sú napnklad agar, algináty, karagénany, celulóza a jej deriváty, kolagén, želatína a polyakrylamid.0003 Menej používanú techniku v porovnani s predchádzajúcimi predstavuje adsorpcia na nosiče, ako sú diatomit, sklo, keramické aplastové materiály, spôsobená elektrostatickým0004 Príklads 6 adsorpcie buniek na iónovýmennú živicu, apresnejšie adsorpcie buniek Escherichía colí na silnú aniónovú výmennú živicu (Dowex 1) bol zverejnený v 1960 - 61, aleneskôr sa V literatúre uvádzali len príklady imobilizácie buniek zvyčajne zachytením na0005 Je to pravdepodobne v dôsledku zatiaľ nedostatočnej stability imobilizácie dosíahnutejadsorpčnými technikami a najmä imobilizácie na živiciach.0006 Bolo by želateľné mať k dispozícii spôsob trvalej imobilizácie buniek adsorpciou na živiciach, pretože takýmto spôsobom bunky nepodliehajú mechanickému namáhaniu ani chemickej degradácii, udržiavajú sa vitálne avmaxímálnej miere si zachovávajú vlastnú schopnosť udržať enzýmy, ktoré produkujú, voptimálnom fyziologickom stave, aby následnekatalyzovali reakcie, ktoré sú potrebné na rôzne biosyntetické a fermentačné postupy.0007 Základný problém predloženého vynálezu bol poskytnúť spôsob trvalej imobilizácie buniek adsorpciou na živice tak, aby sa mohli použiť najmä na reakcie katalyzované enzýmami0008 Tento problém sa podľa vynálezu riešil spôsobom imobilizovania buniek, ktorý zahŕňafázu adsorpcie týchto buniek na živicu, pričom uvedené bunky sú bunky Escherichía colia uvedená živica je slabá aniónová výmenná živica Duolite A 568 ® (Rohm Haas).0009 Pri imobilizácii buniek podľa predloženého vynálezu je pomer medzi hmotnosťou vlhkých buniek (bunková pasta) a hmotnosťou suchej živice v rozsahu medzi 0,5 1 a 2 1,výhodne okolo 1 l. Bunková pasta má hmotnostný podiel vody od 70 do 80 .0010 Imobilizácia sa vykonáva v tlmivom vodnom prostredí pri pH 7,4, výhodne s použitímfosforečnanového tlmívého roztoku s molaritou V rozsahu od 0,1 M do 1 M, výhodne okolo 0,50011 Kontaktný čas medzi živicou a bunkami potrebný na dosiahnutie imobilizácie buniek je vyšší alebo rovný 24 h a výhodne vyšší alebo rovný 72 h.0012 Postupom podľa predloženého vynálezu je tiež možne irnobilizovať na živicí súčasneaspoň dva typy rôznych buniek, ktoré môžu produkovať rôzne enzýmy.0013 Je možné ko-imobilizovať najmä bunky Escherichía coli produkujúce uridin fosforylázu (UP) a bunky Escherichía coli produkujúce purín nukleozid fosforylázu (PNPáza).0014 Ďalším aspektom predloženého vynálezu je proces prípravy nukleozidov, ktorý zahŕňa reverzibilnú reakciu pentózo-l-fosfátu s purínovou alebo pyrimidínovou bázou za prítomnosti buniek produkujúcich UPázu a/alebo PNPázu imobilizovaných vyššie opísaným postupom,pričom uvedené bunky sú bunky druhu Escheríchia colí, 0015 Termín nukleozidy sa vzťahuje tak na prírodné, ako aj na modifikované nukleozidy,takisto terminy purínová báza a pyrimidínova báza sa vzťahujú tak na prírodné bázy, ako aj0016 Podľa ďalšieho uskutočnenia uvedené bunky sú ko-ímobilizované na živici.0017 Ďalším aspektom predloženého vynálezu je spôsob na transglykozyláciu nukleozidov,zahŕňajúcu reakciu medzi pyrimidínovým nukleozidom apurínovou bázou alebo medzi purínovým nukleozidom a pyrimidínovou bázou alebo medzi pyrimidínovým nukleozidom a pyrímidínovou bázou, ktorá sa líši od bázy prítomnej V uvedenom pyrimidínovom nukleozide alebo nakoniec medzi purínovým nukleozidom a purínovou bázou, ktorá sa líši od bázy prítomnej vuvedenom purínovom nukleozíde, pričom táto reakcia prebieha za prítomnosti buniek produkujúcich UPázu abuniek produkujúcich PNPázu alebo za prítomnosti buniek produkujúcich UPázu a PNPázu, pričom uvedené bunky produkujúce UPázu a uvedene bunky produkujúce PNPázu sú bunky Escherichia coli apríčom uvedené bunky sú imobilizovanépostupom imobilizácie opísaným vyššie.0018 Uprednostňuje sa najmä používanie buniek Escheríchia coli z kmeňa DH 5 alfatransformovaných plazmidovými vektormi so sekvenciou obsiahnutou v Seq. Id. No. 1 a 2.0019 Ďalším aspektom predloženého vynálezu je proces transglykozylácíe medzi 2 Íluoroadenínom a arabinoñiranozyl uracílom za vzniku fludarabínu, pričom táto reakcia prebieha za prítomnosti buniek produkujúcich UPázu a buniek produkujúcich PNPázu alebo v prítomnosti buniek produkujúcich UPázu aj PNPázu, pričom uvedene bunky produkujúce UPázu auvedené bunky produkujúce PNPázu sú bunky Escherichia coli a pričom uvedenébunky sú imobilízované postupom imobilizácie opísaným vyššie.0020 Uprednostňuje sa najmä používanie buniek Escheríchia colí z kmeňa DH 5 alfa transformovaných plazmidovými vektormi so sekvenciou obsiahnutou v Seq. Id. No. 1 a 2. Vhodné bunky Escherichia coIi transformované plazmidovými vektormi zo Seq. Id. No.1a plazmidovými vektormi zo Seq. Id. No 2 sú ko-imobilizované na živici.0021 Spôsob imobilizácie buniek podľa predloženého vynálezu sa dosiahol pri výskume apokusoch zameraných na zlepšenie systému biokatalyzátorov použiteľných pri výrobe nukleozidov a modifikovaných analógov, najmä vzťahujúcich sa na fludarabín, najmä0022 Rozhodlo sa, aby sa na tento účel použili reakcie biokonverzie s prokaryotickými enzýmami, ktoré sa uprednostňujú, pretože majú širšiu substrátovú špeciñckosť, dajú sa ľahkozískať vo veľkom množstve z bunkových zdrojov a ich metabolické cesty sú dobre známe.0023 Enzymatické systémy, ktoré sa môžu použiť na biosyntézy prírodných a/alebo modifikovaných nukleozidov, sú najmä dva deoxyribozyl transferázy (DRT) anukleozíd fosforyláza (NP)78.0024 Nevýhodou deoxyribozyl transferáz je vysoká špeciñckosť pre 2-deoxyribózu a z tohtodôvodu sa môžu použiť len pre deoxynukleozidy v polohe 2 .0025 Nukleozid fosforylázy sú enzýmy, ktoré sú prítomné vo väčšine baktérií, kvasiniek atiež vo vyšších eukaryotoch a delia sa do dvoch tried na základe ich kvartémych štruktúr, skladania a typu substrátu, na ktorom pôsobia.0026 Ukázalo sa, že predovšetkým enzýmy uridín fosforyláza (E.C.2.4.2.3) a purín nukleozid fosforyzláza (E.C.2.4.2.1) sú vhodné na reakcie biokonverzie na produkciu molekúl na priemyselné účely, na základe ich vysokej tepelnej stability a schopnosti pôsobiť aj pri vysokej0027 Na rozdiel od DRT majú prokaryotické fosforylázy nižšiu substrátovú špeciñckosť, čo sa týka sacharidov, a sú schopne rozpoznávať napríklad ribózu, deoxyribózu, dideoxyribózu,arabinózu arôzne modifikácie vpolohe 2, 3 alebo 5. Tiež pokiaľ ide o dusrkaté bázy,enzýmy fosforylázy majú nízku substrátovú špecifickosť a sú schopné rozpoznávať okrem viac alebo menej modifikovaných prírodných báz ďalšie heterocyklickć zlúčeniny. Základnou požiadavkou je však prítomnosť atómu dusíka V polohe 1 pri pyrimidínoch av polohe 9 pripurínoch, ktorý sa viaže na uhlík sacharidu hneď, keď sa odstráni fosfát No.0028 Z literatúry sú dobre známe dva enzýmy, obidva v ich sekvencii aminokyseliny, ktorá je uložená v rôznych organizmoch a z geneticko-molekulámeho hľadiska. V skutočnosti sú známe gény, ktoré ich kódujú (UdP pre uridín fosforylázu a deoD pre purín nukleozid fosforylázu)a pridružené sekvencie sú dostupné V príslušných databázach.0029 Oba enzýmy patria kobnovovacej ceste nukleozidov akatalýzy za prítomnosti fosforečnanových iónov, reverzíbilnej fosforolýzy nukleosidov za vzniku sacharid-l-fosfátua príslušnej heterocyklickej bázy tak, ako sa znázorňuje V nasledujúcej schémeUPáza pyrimidín nukleozid Pi pyrimidínová báza pentóza - l - P

MPK / Značky

MPK: C12P 19/00, C12N 11/00, C12N 15/70

Značky: buniek, živici, spôsob, imobilizácie

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/37-e7220-sposob-imobilizacie-buniek-na-zivici.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob imobilizácie buniek na živici</a>

Podobne patenty