Granzým ako od HSP70/HSP70 peptidu závislý vyvolávač apoptózy v rakovinových bunkách

Číslo patentu: E 7334

Dátum: 22.08.2003

Autor: Multhoff Gabriele

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Granzým ako od HSP 70/HSP 70 peptidu závislý vyvolávač apoptózy v rakovinových bunkách Opis0001 Vynález sa týka spôsobu ex vivo vyvolania alebo zosilnenia expresie granzýmu B v prirodzených zabijačských (NK) bunkách. Ďalej sa vynález týka granzýmu B na použitie priliečbe nádorov, kde nádorové bunky exprimujú na svojom povrchu Hsp 70.0002 Bolo zistené, že zvýšené cytoplazmaticke hladiny proteínu teplotného šoku 70 (Hsp 70) chránia nádorové bunky pred programovanou bunečnou smrťou (Nylandsted et al. (2000) Ann. N.Y. Acad. Sci. 926, 122). Hsp 7 O je hlavná stresom indukovateľná forma rodiny proteínov teplotného šoku (HSP), ktorá sa primárne nachádza v cytosóle. Dôkazy zhromaždené V poslednom čase preukazujú, že HSP umiestnené extraceluláme a HSP viazané na plazmatické membrány sú vysoko imunogénne a vystavujú bunky imunitnému ataku (Schild et al. (1999) Current Opinion in Immunology 11, 109). Po absorpcii sprostredkovanej receptormi (AmoldSchild et al. (1999) J. Immunol. 162, 3757) a reprezentácii antigén prezentujúcimi bunkami(APC) vyvolávajú peptidy zbalené pomocou HSP cytotoxickú odpoveď CD 8 T buniek (Suto et al. (1995) Science 269, 1585). Bolo identifikovaných niekoľko receptorov, vrátane CD 91 a receptorov 2 a 4 podobných génu Toll (TLR 2/4), ktoré siprostredkovávajú interakciu peptidických komplexov HSP 9 O (gp 96), HSP 70 (Hsp 70, Hsc 70) a HSP 60 s APC (Basu et al.(2001) Immunity 14, 303 Binder et al. (2000) Nat. Immunol. l, 151 Sondermann et al. (2000) Biol. Chem. 381, 1165. Ohashi et al. (2000) J. Immunol. 164, 558). Pre členy skupiny HSP 70 bol opísaný od peptidov nezávislý chaperokínový efekt. Väzba exogenneho HSP 70 na monocyty cez T LR 2/4 cestou závislou od CD 14 indukuje zhlukovanie receptorov a sekréciu prozápalových cytokínov prenosom signálu MyD 88/IRAK/NF 1 c-B (Pfeiffer et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31, 3153 Asea et al. (2000) Nature Medicine, 6, 435 Asea et al. (2000) Cell Stress Chaperones, 5, 425 Asea et al. (2002) J Biol Chem. 277(17), 15028).0003 Zistilo sa, že NK bunky špecificky interagujú s epitopom Hsp 7 O umiestneným Ctermínálne (Botzler et al. (1998) Cell Stress Chaperones, 3, 6), ktorý je prezentovaný na bunečnej membráne nádorových buniek (Multhoff et al. (1995) Int. J. Cancer, 61, 272 Multhoñ et al. (1997) J. Immunol. 158, 4341). Množstvo Hsp 7 O viazaného na membránu na nádorových bunkách pozitívne koreluje so senzitivitou na lýzu sprostredkovanú NK bunkami Zistilo sa, že expresiu Hsp 7 O povrchom buniek na nádorových bunkách zvyšuje fyzikálny(teplo) aj chemický (cytostatiká) stres, a tak ich činí lepšimi cieľmi pre NK bunky (Multhoff(1997) Int. J. Hyperthermia 13, 39 Botzler et al. (1999) Exp. Hematol. 27, 470 Rabinovich et al. (2000) J. Immunol. 165, 2390 Feng et al. (2001) Blood 97, 3505). Inkubácia čistených NK buniek s rekombinantným proteínom Hsp 70 zvyšuje ich cytolytickú aktivitu voči nádorovým bunkám smembránami pozitívnymi na Hsp 70 (Multhoff et al. (1999) Exp. Hematology 27,1627). Rovnaký efekt sa dosahuje pomocou peptidu so 14 aminokyselinami, označovaného TKD (TKDNNLLGRFELSG, aa 450-463), odvodeného od C-terminálnej domény Hsp 70. Táto oblast zodpovedá doméne Hsp 70 vystavenej extracelulámemu prostrediu životaschopných nádorových buniek (MulthoíY et al. (2001) Cell Stress Chaperones 6, 337). Súbežne so zvýšenou cytolytickou aktivitou bola po kontakte buď sproteínom Hsp 70 alebo speptidom TKD proteínu Hsp 70 zvýšená u NK buniek na bunečnom povrchu expresia aktivujúca formy lektínového receptora typu C CD 94. Blokovacie testy s použitím inhibičnej protilátky špecifickej pre CD 94 ukázali účasť CD 94 pri interakcii NK buniek s nádorovými bunkami s membránami pozitívnymi na Hsp 70 (Multhoff et al. (1999) Exp. Hematology 27, 1627), Tieto dáta naznačujú, že okrem HLA-E prezentujúcich vedúce peptidy klasických alel HLA (Lanier et al. (1998) Immunity 8, 693 Braud et al. (1998) Nature 391, 795) môže byt aj TKD sekvencia peptidu Hsp 70 umiestnená terrninálne považovaná za potenciálny ligand pre doteraz nedeñnovaný aktivačný receptorový komplex CD 94. Hoci predchádzajúce pozorovania naznačujú, že peptid Hsp 70 funguje ako nádorovo selektívna cieľová rozpoznávacia štruktúra pre CD 94 pozitívne NK bunky (Multhoff et al. (1997) J. Irnmunol. 158, 4341), mechanizmus,ktorým NK bunky lýzujú Hsp 70 pozitívne cieľové nádorové bunky, je ešte potrebné osvetliť. Okrem toho je žiaduce špecificky spúšťať lyticlcú aktivitu NK buniek voči nádorovým bunkám špeoiñckejšie než bolo doteraz možné. Všetky tieto výskumné ciele slúžia ako prostriedok na vyvinutie účinnejších a špecifickejších prístupov na liečenie ochorení, a najmä na liečenie0004 Bolo referované, že povrchová expresia proteínov teplotného šoku vrátane Hsp 70 sa vyskytuje tiež po vírusovej infekcii alebo V reakcii na stres. Konkrétne bol membránový Hsp 70 nájdený V HIV-infikovaných lymfatických bunkách (Di Cesare et al. (1992), Immunology 76,341) a v HTLV I-infikovaných králičích bunečných liniách (Chouchane et al. (1994), J. Infect. Dis. 169, 253). Podobne si je možné predstaviť, že bunky infikované baktériami alebo postihnuté zápalom exprimujú Hsp 70 na svojom bunečnom povrchu. Lytická aktivita NKbuniek alebo granzýmu B teda môže byť zameraná voči bunkám inñkovaným vírusmi alebobaktériami, rovnako ako voči bunkám postihnutým zápalom.0005 Stav techniky zahŕňa taktiež tieto zisteniaWO 99/49881 anti-tumorálne účinky NK buniek na nádorové bunky exprimujúce na bunečnom povrchu Hsp 7 O (príklady 2 a 3)W 0 01/80880 odkaz na str. 7 a 8 na produkciu granzýmu B aktivovanými NK bunkami.5 0006 Technický problém, na ktorom je založený tento vynález, teda spočíval v poskytnutí prostriedkov a metód špecifickej liečby ochorení, najmä nádorov, vírusových a bakteriálnych0007 Riešenia tohto problému sa dosahuje uskutočneníami charakterizovanými10 0008 Vynález sa teda týka spôsobu ex vivo indukcie alebo zosilňovania expresie granzýmu BV prirodzených zabíjačských (NK) bunkach, zahŕňajúceho uvedenie NK buniek do kontaktu s(b) (C-terminálnym) fragmentom (a) zahŕňajúcim aminokyselinovú sekvenciu TKDNNLLGRFELSG 15 (c) (poly)peptidom zahŕňajúcim aminokyselinovú sekvenciu TKDNNLLGRFELSG alebo0009 Granzým B je serínová proteáza, v odbore známa, o ktorej sa uvádza, že sa zúčastňuje na procese apoptózy/programovanej bunečnej smrti (Berke (1995) Cell, 8 l(1), 9-12 Froelich et al. (1998) lmmunology Today, l 9(l), 30-26) Metkar S et al. Cytotoxic cell granule-mediated 20 apoptosís perforin delivers granzýme B serglycin complexes into target cells without plasma0010 Tento enzým podporuje fragmentáciu DNA štiepením prokaspáz na ich aktivovanú formu, a tým vyvoláva programovanú smrť buniek cestou, ktorá je inhibovateľná pomocou Bcl 2. Granzým B začína proces apoptózy indukovať pri prítomnosti v cytosóle cieľovej bunky.25 0011 Výraz NK bunky (prirodzene zabíjačské bunky) zahŕňa veľké granuláme lymfocyty exprimujúce na povrchu CD 45 a vykazujúce zabíjačskú aktivitu bez predchádzajúcej stimulácie. Sú charakterizované najmä tým, že neexprimujú CD 3 alebo receptor (1/3- alebo y/ö T buniek amôžu byť stimulovane interleukínom-2.0012 NK bunky, stimulované spôsobom podľa vynálezu, sú ďalej charakterizované týmito vlastnosťamio prechodne uľpievajú na plaste po prídavku IL-2 v množstve 10 až 10 000 jednotiek, napríklad 100 IU, kde IL-Z je možné zakúpiť u firmy Chirono uľpievanie trvá 3-18 h po prídavku IL-Z na novo izolované PBL (lymfocytyperiférnej krvi zbavenej monocytov) o NK bunky vykazujú expresíu CDl ődim (priemerná hodnota fluorescencie slabá) o NK bunky exprimujú CD 56 a CDS 7 ako typický marker NK o NK bunky exprimujú CD 94 (lektínový receptor zabíjačskej bunky typu C) o NK bunky vylučujú po aktivácii pomocou Hsp 70 a cytokínov IFNgammao NK bunky môžu byť stimulované prídavkom Hsp 70, fragrnentu Hsp 70 alebo peptidu Hsp 70 (čistený proteín) (rastová a cytotoxická aktivita)o nie sú závislé od typu MHC pacienta.Podľa vynálezu môžu byť použite tiež iné populácie NK buniek. V odbore sú známe ďalšie metódy získania takej populácie, ktoré zahŕňajú izoláciu s použitím magnetických perličiek a triedenie buniek. V tomto prípade je však podmienkou, aby mohli byť aktivované pomocou Hsp 70 alebo vyššie uvedených fragmentov alebo (poly)peptidov. Podľa vynálezu môžu byť použité izolované NK bunky. Ďalej je možné používať zmesi buniek, ako sú periférnemononukleárne krvné bunky (PBMC) obsahujúce NK bunky.0013 Vo zvlášť výhodnom uskutočnení ex vivo metódy podľa vynálezu sa periféme mononuldeáme krvné bunky (PBMC) alebo ich frakcie obsahujúce NK bunky používajú ako0014 Pomocou vhodných metód je možné NK bunky získať od pacientov, ktorí majú podstúpiť liečbu, alebo od zdravého darcu odberom krvi. Prednostne je vhodné používať buffycoats alebo lyrnfocytové koncentráty získané inými prostriedkami obsahujúce NK bunky.0015 Buffy-coats alebo lymfocytovć koncentráty sa odoberajú zo žily pacientov a na prevenciu zrážania buniek sa pridáva napríklad heparín. Buffy-coats, ku ktorým bol pridaný heparín, sa zhromažďujú v sterilnej nádobe (obvykle sterilných plastových Vreckách) a potomsa odstredia pomocou hustotnej centrifugácie Ficoll, ktorá vedie k akumulácii krvných buniek

MPK / Značky

MPK: A61K 38/43, C12N 5/07, A61K 35/14

Značky: buňkách, závislý, vyvolávač, granzým, apoptózy, rakovinových, peptidů

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/36-e7334-granzym-ako-od-hsp70-hsp70-peptidu-zavisly-vyvolavac-apoptozy-v-rakovinovych-bunkach.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Granzým ako od HSP70/HSP70 peptidu závislý vyvolávač apoptózy v rakovinových bunkách</a>

Podobne patenty