Inžinierstvo systémov, spôsobov a optimalizovaných vodiacich prostriedkov na manipuláciu so sekvenciami

Číslo patentu: E 20039

Dátum: 12.12.2013

Autori: Cong Le, Ran Fei, Zhang Feng, Hsu Patrick

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0002 Predkladan v nález sa všeobecne ka s stémov, s ôsobov a kom ozíciíY Y P používaných na kontrolu génovej expresie zahŕňajúcich zacielenie sekvencie, ako je perturbácia genómu alebo génové editovanie, ktoré môže využívať vektorové systémypríbuzné so zoskupenými pravidelne rozmiestnenými krátkymi palindromickými repetíciami0003 Nedávne pokroky v technikách sekvenovania genómu a analytických metódach výrazne zrýchlili schopnosť katalogizovať a mapovať genetické faktory spojené s rozmanitou škálou biologických funkcií a chorôb. Technológie presného zacielenia do genómu sú potrebné na to, aby umožnili systematické reverzné inžinierstvo príčinných genetických variácií tým, že umožnia selektívne zmeny (perturbáciu) jednotlivých genetických elementov,ako aj pokrok V syntetickej biológii a biotechnologických a lekárskych aplikáciách. Aj ked techniky editovania genómu, ako sú napríklad zinkové prsty (designer zinc ñngers),efektory podobne transkripčným aktivátorom (TALE) alebo navádzané (homing) meganukleázy sú k dispozícii na produkciu cielených perturbácií genómu, zostáva potreba nových technológií cieleného pozmeňovania genómu, ktoré sú cenovo dostupné, ľahko nastaviteľné, škálovateľné a prístupné na zacielenie do viacerých polôh v rámci0004 Existuje naliehavá potreba altematívnych a robustných systémov a techník na zacielenie sekvencií so širokou škálou aplikácií. Tento vynález sa zameriava na túto potrebu a poskytuje súvisiace výhody. Systém CRISPR/CAS alebo CRISPR-Cas (oba výrazy sú V tejto patentovej prihláške navzájom zameniteľnć) nevyžaduje generovanie upravených proteínov na zacielenie do špecifických sekvencií, ale skôr sa jediný enzým Cas môže naprogramovať krátkou RNA molekulou, aby rozpoznal konkrétny cieľ (target) na DNA, inými slovami enzým Cas sa môže upraviť pre konkrétny cieľ na DNA pri použití uvedenej krátkej RNAmolekuly. Pridanie systému CRISPR-Cas do repertoára techník sekvenovania genómu aanalytických metód môže výrazne zjednodušiť metodiku a urýchliť schopnosť katalogizovať a mapovať genetické faktory spojené s rozmanitou škálou biologických funkcii a chorôb. Ak sa má systém CRISPR-Cas efektívne využívať na editovanie genómu bez škodlivých účinkov,je dôležité pochopiť aspekty inžinierstva a optimalizácie týchto nástrojov upravujúcichgenóm, ktoré sú aspektmi nárokovaného vynálezu.0005 V jednom aspekte tento vynález opisuje vektorový systém zahŕňajúci jeden alebo viac vektorov. V niektorých uskutočneniach systém zahŕňa (a) prvý regulačný element funkčne pripojený na párovú sekvenciu tracr ajedno alebo viac inzerčných miest na vloženie jednej alebo viacerých vodiacich sekvencií (guide sequences) pred párovú sekvenciu tracr, kde pri expresii vodiacej sekvencie riadi sekvenčne špecifické naviazanie komplexu CRISPR na cieľovú sekvenciu v bunke, napriklad V eukaryotickej bunke, pričom komplex CRISPR sa skladá z enzýmu CRISPR v komplexe s (l) vodiacou sekvenciou, ktorá hybridizuje s cieľovou sekvenciou, a (2) párovou sekvenciou tracr, ktorá hybridizuje so sekvenciou tracr a(b) druhý regulačný element funkčne pripojený na sekvenciu kódujúcu uvedený enzým CRISPR zahŕňajúci jadrovú lokalizačnú sekvenciu (NLS) pričom komponenty (a) a (b) sú umiestnené na rovnakých alebo rôznych vektoroch systému. V niektorých uskutočneniach komponent (a) ďalej zahŕňa sekvenciu tracr nasledujúcu za párovou sekvenciou tracr pod kontrolou prvého regulačného elementu. V niektorých uskutočneniach komponent (a) ďalej zahŕňa dve alebo viac vodiacich sekvencií funkčne pripojených na prvý regulačný element,pričom pri expresii každej z dvoch alebo viacerých vodiacich sekvencií riadi sekvenčne špecifické naviazanie komplexu CRISPR na inú cieľovú sekvenciu V eukaryotickej bunke. V niektorých uskutočneniach sa systém skladá zo sekvencie tracr pod kontrolou tretieho regulačného elementu, ako je napriklad promótor polymerázy III. V niektorých uskutočneniach sa sekvencia tracr vyznačuje aspoň 50 , 60 , 70 , 80 , 90 , 95 alebo 99 sekvenčnou komplementaritou V celej dĺžke párovej sekvencie tracr, pokial sú optimálne zarovnané. V niektorých uskutočneniach sa komplex CRISPR skladá zjednej alebo viacerýchjadrových lokalizačných sekvencií s dostatočnou silou tak, aby riadili akumuláciu uvedeného komplexu CRISPR v zístiteľnom množstve vjadre eukaryotickej bunky. Bez toho,aby si autori želali viazať sa na akúkoľvek teóriu sa predpokladá, že jadrová lokalizačná sekvencia nie je nutná pre činnosť komplexu CRISPR v eukaryotoch, ale zahmutie takýchto sekvencií zvyšuje aktivitu systému, najmä pokiaľ ide o zacielenie molekúl nukleovej kyselinydo jadra. V niektorých uskutočneniach je enzýmom CRISPR enzým systému CRISPR typu II.V niektorých uskutočneniach je enzýmom CRISPR enzým Cas 9. V niektorých uskutočneníach je enzýmom Cas 9 enzým Cas 9 z S. pneumoniae, S. pyogenes alebo S. thermophilus a môže zahŕňať mutovaný Cas 9 odvodený z týchto organizmov. Enzýmom môže byť homológ alebo ortológ Cas 9. V niektorých uskutočneniachje enzým CRISPR kodónovo Optimalizovaný (codon-optimized) na expresiu V eukaryotickej bunke. V niektorých uskutočneniach enzým CRISPR riadi štiepeníe jedného alebo dvoch reťazcov V mieste cieľovej sekvencie. V niektorých uskutočneniach enzýmu CRISPR chýba aktivita na štiepenie DNA reťazca. V niektorých uskutočneniachje prvým regulačným elementom promótor polymerázy III. V niektorých uskutočneniachje druhým regulačným elementom promótor polymerázy II. V niektorých uskutočneniach má vodiaca sekvencia dĺžku aspoň 15,16, 17, 18, 19, 20, 25 nukleotídov, alebo medzi 10 až 30, alebo medzi 15 až 25, alebo medzi 15 až 20 nukleotidmi. V tomto opise všeobecne platí, že Výraz Vektor sa vzťahuje na molekulu nukleovej kyseliny schopnú transportovať inú nukleovú kyselinu, ktorá na ňu bola pripojená. Vektory zahŕňajú, ale bez toho, aby na ne boli obmedzené, molekuly nukleových kyselín, ktoré sú jednoreťazcové, dvojreťazcove alebo čiastočne dvojreťazcové molekuly nukleových kyselín, ktore obsahujújeden alebo viac voľných koncov, žiadne Voľné konce(napríklad kruhové mo lekuly) molekuly nukleovej kyseliny, ktoré obsahujú DNA, RNA alebo obe a ďalšie druhy polynukleotidov známych V tejto oblasti. Jedným typom vektora je plazmid, ktorý sa vzťahuje na kruhovú dvojreťazcovú DNA slučku, do ktorej sa môžu vložiť ďalšie segmenty DNA, napríklad štandardnými technikami mo lekulámeho klonovania. Ďalším typom vektora je Vírusový Vektor, V ktorom sú sekvencie DNA alebo RNA odvodené z vírusu prítomné vo vektore umožňujúcom balenie do vírusových častíc (napríklad retrovírusy, replikačne defektné retrovírusy, adenovírusy, replikačne defektné adenovírusy a adeno-asociované Vírusy). Vírusové vektory zahŕňajú aj polynukleotidy prenášané vírusom na transfekciu do hostiteľskej bunky. Niektore vektory sú schopné autonómnej replikácie V hostiteľskej bunke, do ktorej sú zavedené (napríklad bakteriálne vektory, ktoré majú bakteriálny počiatok replikácie a epizomálne cicavčie vektory). Iné vektory (napríklad neepizomálne cicavčie vektory) sú integrované do genómu hostiteľskej bunky po zavedení do hostiteľskej bunky, a tým sú replikované spolu s hostiteľským genómom. Okrem toho niektoré vektory sú schopné riadiť expresiu génov, na ktore sú funkčne pripojené. Takéto vektory sa V tomto dokumente označujú ako expresné vektory. Bežné expresné vektorypoužiteľné pri technikách rekombinantnej DNA sú často vo forme plazmidov.0006 Rekombinantné expresne vektory môžu zahŕňať nukleovú kyselinu v 0 forme vhodnej na jej expresiu v hostiteľskej bunke, čo znamená, že rekombinantné expresné vektory obsahujújeden alebo viac regulačných elementov, ktoré sa môžu vybrať na základe hostíteľských buniek použitých na expresiu, ktoré sú funkčne pripojené na sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá má byť exprimovaná. V rámci rekombinantného expresného vektora výraz funkčne pripojená znamená, že nukleotidová sekvencía, o ktorú je záujem, je spojená s regulačným elementom alebo elementmi, a to spôsobom, ktorý umožňuje expresiu nukleotidovej sekvencie (napríklad v in vitro transkripčnom/translačnom systéme alebo vhostiteľskej bunke, keď je Vektor zavedený do hostiteľskej bunky).0007 Výraz regulačný element zahŕňa promótory, zosilňovače, vnútomé ribozomálne vstupné miesta (IRES) a iné elementy na kontrolu expresie (napríklad signály na ukončenie transkripcie, ako sú polyadenylačné signály a poly-U sekvencie). Takéto regulačné elementy sa opisujú napriklad V Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Regulačné elementy zahŕňajú tie, ktoré riadia konštitutívnu expresiu nukleotidovej sekvencie v mnohých typoch hostíteľských buniek, a tie, ktoré riadia expresiu nukleotidovej sekvencie len v určitých hostíteľských bunkách (napriklad regulačné sekvencie špecifické pre tkanivo). Promótor špecifický pre tkanivo môže riadiť expresiu predovšetkým v požadovanom tkanive, ako je napriklad sval, neurón, kosť, koža, krv, špecifický orgán (napríklad pečeň, pankreas), alebo v určitých bunkových typoch (napríklad v lymfocytoch). Regulačné elementy môžu riadiť expresiu aj spôsobom závislým od času, ako napríklad spôsobom závislým od bunkového cyklu alebo od vývojového štádia, ktorý tiež môže byť alebo nemusí byť závislý od tkaniva alebo od bunky. V niektorých uskutočneniach Vektor zahŕňajeden alebo viac promótorov Pol III (napriklad l, 2, 3, 4, 5 alebo viac promótorov Pol III), jeden alebo viac promótorov Pol II(napriklad l, 2, 3, 4, 5 alebo viac promótorov Pol II), jeden alebo viac promótorov Pol I(napríklad l, 2, 3, 4, 5 alebo viac promótorov Pol I), alebo ich kombinácie. Priklady Pol III zahŕňajú, ale bez toho, aby na ne boli obmedzené, U 6 a H 1 promótory. Príklady promótorov Pol II zahŕňajú, ale bez toho, aby na ne boli obmedzené, retrovírusový promótor LTR,promótor vírusu Rousovho sarkómu (RSV) (pripadne s RSV enhancerom), promótor cytomegalovírusu (CMV) (prípadne s CMV enhancerom) pozri napríklad Boshart et al., Cell,41 strana 521 až 530 (l 985), promótor SV 40, promótor dihydrofolátreduktázy, B-aktinový promótor, promótor fosfoglycerolkinázy (PGK) a promótor EF la. Pod výraz regulačný ele

MPK / Značky

MPK: C12N 15/63

Značky: manipuláciu, sekvenciami, vodiacich, systémov, spôsobov, optimalizovaných, inžinierstvo, prostriedkov

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/333-e20039-inzinierstvo-systemov-sposobov-a-optimalizovanych-vodiacich-prostriedkov-na-manipulaciu-so-sekvenciami.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Inžinierstvo systémov, spôsobov a optimalizovaných vodiacich prostriedkov na manipuláciu so sekvenciami</a>

Podobne patenty