Nové proNGF mutanty a ich použitie pri produkcii beta-NGF

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Tento vynález sa týka nových proNGF mutantov, ktoré majú substitúciu v natívnom proteázovom štiepiacom mieste. Predložený vynález ďalej opisuje spôsob na výrobu biologicky aktívneho ľudského beta-NGF z inaktívneho nerozpustného proNGF mutanta a použitie proNGF mutanta na produkciu ľudského beta-NGF.Nervový rastový faktor (beta-NGF) je neurotrofným faktorom, ktorý hrá kľúčovú úlohu pri raste a prežití neurónov (senzorických a sympatických) (Levi-Montalcini, R., Science 237 (1987) 1154 Thoenen, H., et al., Physiol. Rev. 60 (1980) 1284 Yankner, B. A., et al., Annu. Rev. Biochem. 51 (1982) 845). Beta-NGF patrí do nadradenej skupiny rastových faktorov sdisulfidovým mostíkom medzi dvomi cysteínmí, ktoré majú stabilnú dimému proteínovú štruktúru. Beta-NGF ďalej podporuje rast, diferenciáciu a vitalitu cholinergných neurónov centrálnej nervovej sústavy (Heíti, F. J., J. Neurobiol. 25 (1994) 1418). Možné terapeutické indikácie pre rekombinantný ľudský nervový rastový faktor zahŕňajú periféme senzorické neuropatie, napriklad združené s diabetom alebo ako možný vedľajší účinok pri terapii AIDS. Ďalšie indikácie pre beta-NGF sú centrálne neuropatie, napríklad Alzheimerova choroba. V tomto prípade je strata pamäti dôsledkom straty cholinergných neurónov. O Beta-NGF sa tiež zistilo, že je účinný pri liečení ľudských kožných a komeálnych vredov (Bemabei et al. Lancet 1999 Lambiase et al. NEJM 1998). Okrem toho sa tiež preukázalo, že beta-NGF chránenie retinálnej bunky pred degeneráciou a apoptózou v rámci experimentálneho zvieracieho modelu glaukómu a že zlepšuje vizuálnu funkciu u niekoľkých málo pacientov trpiacich glaukómomZrelý ľudský beta-NGF je proteínom s l 18 aminokyselinami, ktorý je transláciou zostavený ako proproteín zložený z 241 aminokyselín. Signálny peptid (prepeptid) s 18 aminokyselinami sa štíepi v priebehu translokácie na endoplazmatické retikulum (ER). Výsledný proproteín(proNGF) sa spracuje na jeho N-konci odstránením pro-sekvencie proteázovým štiepenim. Zrelý ľudský NGF vykazuje vysoký stupeň identity (asi 90 ) voči beta-NGF hlodavcov (myši a potkany). Pre klinické štúdie alebo terapeutické použitie musia byť beta-NGF poskytnuté vo vysokých koncentráciách. Submaxilárne žľazy myší sú prírodným zdrojom beta-NGF. Avšaktieto beta-NGF prípravky sú heterogénnymi zmesami rôznych dimérov a teda nie sú vhodné naterapeutické použitie. Okrem toho je žiaduce podávať pacientom ľudskú formu proteínu. Avšak v ľudských tkanivách sú neurotrofné faktory prítomné iba V nízkych koncentráciách. Prosekvencia je doména oddelená od zrelého proteínu (pozri sekvenčné údaje uvedené na obr. l,kde je prosekvencia vyznačená hrubo). Tieto dve domény sú oddelené nechráneným proteázovým štiepnym miestom s bázickou aminokyselinovou cieliacou sekvenciu typu Arg-SerLys-Arg nachádzajúcu sa v polohách 101 až 104 ľudskej proNGF sekvencie (SEQ ID NO l),Tento motív je prirodzeným štiepiacim miestom pre serín-endoproteázu Furín. Dodatočne sa môže toto štiepiace miesto špecificky spracovať inými vhodnými proteázami, výhodne proteázami so substrátovou špeciñckosťou štiepenia po aminokyseline Arginín (Arg, R). Tak napríklad proteáza trypsín štiepi za bázickými aminokyselinami, akými sú Lyzín (Lys, K) alebo Arginín (Arg, R).Spôsoby prípravy biologicky aktívneho beta-NGF z jeho inaktívnej predformy sú veľmi dobre známe v rámci doterajšieho stavu techniky. Takto napríklad európsky patent EP O 994 188 B 1 opisuje spôsob prípravy biologicky aktívneho beta-NGF z jeho inaktívnej pro-formy, ktorá má nízku rozpustnosť. Podľa tohto spôsobu je beta-NGF získateľný z rekombinantného nerozpustného inaktívneho proNGF, ktorý je rozpustený V denaturujúcom roztoku. Potom sa rozpustený proNGF prevedie do nedenaturujúceho alebo slabo denaturujúceho roztoku. Denaturovaný proNGF má predpokladanú biologicky aktívnu konformáciu, ako je to určené disulfidovými mostíkmi prítomnými v natívnom beta-NGF. Následne sa odštiepi prosekvencia faktora proNGF, čím sa získa aktívny beta-NGF.Ľudský proNGF obsahuje natívne proteázové (Furín) štiepiace miesto Arg-Ser-Arg a má takto nasledujúci sekvenčný motív R 1 SK 3 R 4. V prípade spôsobov výroby, akými sú spôsoby vyžadujúce kvalitatívne úrovne dobrej výrobnej praxe (GMP), musia byť materiály, ako napríklad enzýmy, poskytnuté vo vysokej kvalite. Proteáza Furín nie je bežne dostupná ako proteáza v kvalite GMP.Preto sa na štepenie proNGF za účelom získania zrelého beta-NGF proteínu zvolila alternatívna proteáza Trypsín (EC 3.4.2 l.4), Serín-proteáza Trypsín štiepi peptidové reťazce na karboxylovej strane bázických aminokyselín Arginínu alebo Lysínu. V prípade ľudského proNGF obsahuje prirodzene sa vyskytujúce štiepiace miesto v ľudskom proNGF tri polohy s bázickými aminokyselinami (polohy 101, 103 a 104 sekvencie SEQ ID NO l alternatívne sú tu uvádzané ako R 1, K 3 a R 4). Takto môže štepenie proNGF Trypsínom viesť k mnohým odlišným štiepnym produktom podľa toho, kde presne štiepenie prebieha. Typické štiepne produkty sú SK 3 R 4-betaNGF a R 4-beta-NGF a zrelý beta-NGF. Tento problém sa ešte ďalej zhoršuje tým, že dimerizáciabeta-NGF proteínu povedie k ešte väčšiemu počtu (až l šiestich) nehomogénnych produktov,ktore sa musia čistiť v nasledujúcich krokoch (pozri obr. 2).US 2008050776 uvádza proNGF molekuly pripravené viacpočctnými mutáciami na všetkých troch hlavných proteázovo citlivých dibázických miestach pro-domény prírodného pro NGF. Výhodné uskutočnenie je substitúcia K 3 alanínom. Uvedené proNGF mutanty sú stabilné vočiTechnické problémy, ktorým musí predložený vynález čeliť a ich riešenieSpôsoby výroby betaNGF boli opisane v rámci doterajšieho stavu techniky. Avšak bežne dostupné výrobné spôsoby mali niektoré nedostatky, ako sú nehomogénne beta-NGF produkty a nízke výťažky beta-NGF.Štiepenie pro-NGF divokého typu Trypsínon za účelom výroby beta-NGF vykazuje nízku účinnosť, ktorá vyžaduje použitie veľmi vysokých množstiev enzýmu, aby sa dosiahlo dostatočného výťažku štiepeného beta-NGF. Toto má niektoré nežiaduce dopady na následný postup čistenia. Predovšetkým to ďalej znižuje selektivitu štiepenia, čo vedie k niekoľkým produktom digescie. Ďalej je potrebne čistenie beta-NGF od enzýmu alebo enzým nesmie byť prítomný v konečnej vzorke proteínu. Toto vyžaduje niektoré postupy čistenia za účelom odstránenia nadbytočného Trypsínu. Teda použitie Trypsínu ako štiepiaceho enzýmu pri spôsobe podľa doterajšieho stavu techniky vedie buď k veľmi nízkym výťažkom beta-NGF alebo k problémom s čistením proteínu.Je zbytočné hovoriť, že tu v stave techniky zostáva potreba mať k dispozícii spôsob výroby betaNGF, ktorý nie je zaťažený vyššie uvedenými nedostatkami. Teda problém určeným na riešenie predloženým vynálezomje poskytnutie nového spôsobu výroby beta-NGF, ktorý sa má získať vo vysokej kvalite, s vysokou účinnosťou a vo vysokých výťažkoch. Ďalej problémom určeným na riešenie predloženým vynálezom je poskytnutie spôsobu výroby beta-NGF, ktorým sa dosahuje vysokých výťažkov beta-NGF, ktorý je účinný, robustný, uskutočniteľný v požadovanom meradle a reprodukovateľný.Výhodou vynálezu je výroba beta-NGF z nového proNGF mutantu. Tento nový mutant poskytuje homogénne beta-NGF produkty v dobrom výťažku, pretože uvedený nový proNGF mutant bráni nehomogénnej dígescii proteázami a v dôsledku toho sa získajú nehomogénne betaNGF produkty. Problém podľa vynálezu sa rieši poskytnutím proNGF mutanta podľa vynálezu aspôsobu produkcie beta-NGF z proNGF mutanta opísaného v rámci predloženého vynálezu.Uvedený nový mutant má za následok neočakávané a pozoruhodné zvýšenie účinnosti štiepenía tripsínom v relevantnom mieste V mutovanom proNGF podľa vynálezu V porovnaní s divokým typom. Toto umožňuje použitie extrémne nízkych množstiev proteázy trypsínu v porovnaní s množstvom, ktoré by sa muselo použiť V prípade divokého typu, čo má za následok obmedzenie problémov s čistením beta NGF od samotného enzýmu a od produktov štiepenia. Vyššie opísané problémy sú vyriešené a uvedené výhody sú dosiahnuté predmetom nezávislých nárokov. Výhodné uskutočnenia vynálezu sú zahrnuté v závislých nárokoch, ako aj v nasledujúcej opisnej časti, v nasledujúcich príkladoch a na nasledujúcich obrázkoch.Vyššie uvedený výpočet neopisuje nevyhnutne všetky problémy riešené týmto vynálezom. Ďalšie problémy a to, ako sa riešili, bude odborníkovi V danom odbore zrejmé po preštudovaníV rámci prvého aspektu sa tento vynález týka proNGF mutanta, pričom proteázové štiepiace miesto RSK 3 R 4 je substituované v polohách R a K 3 zodpovedajúcich polohám 101 a 103 ľudskej proNGF sekvencie divokého typu (SEQ ID NO l) Valínom v polohe 101 a Alanínom v polohe 103.V rámci druhého aspektu sa tento vynález týka spôsobu prípravy biologicky aktívneho ľudského beta-NGF z inaktívneho nerozpustného proNGF mutanta substituovaného v natívnom proteázovom štiepiacom mieste R 1 SK 3 R 4 v polohách R a K 3 zodpovedajúcich polohám 101 a 103 ľudskej proNGF sekvencie divokého typu (SEG ID NO l) Valínom V polohe 101 a Alanínom v polohe 103, pričom tento spôsob obsahuje (i) poskytnutie proNGF podľa tohto vynálezu a (ii) štiepenie proNGF mutanta za účelom získania aktívneho ľudského betaNGF. Obzvlášť sa vynález týka nasledujúceho spôsobu, ktorý zahŕňaa. rozpustenie proNGF mutanta podľa vynálezu v denaturujúcom roztokub. prenesenie proNGF mutantu do opätovne skladajúceho roztoku, v ktorom denaturovaný proNGF prime biologicky aktívnu konformáciuc. čistenie proNGF mutanta od opätovne skladajúceho roztokud. štiepenie pro-sekvencie proNGF mutanta na získanie aktívneho beta-NGF.V rámci tretieho aspektu sa vynález týka použitia proNGF mutanta podľa vynálezu na prípravu ľudského beta-NGF.Tento súhm vynálezu nie nevyhnutne opisuje všetky znaky tohto vynálezu. Ďalšie uskutočnenia

MPK / Značky

MPK: A61K 38/18, C07K 14/48

Značky: produkcii, nové, použitie, beta-ngf, prongf, mutanty

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/32-e19171-nove-prongf-mutanty-a-ich-pouzitie-pri-produkcii-beta-ngf.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Nové proNGF mutanty a ich použitie pri produkcii beta-NGF</a>

Podobne patenty