Použitie RNAi inhibujúcej aktivitu PARP na výrobu lieku na liečenie rakoviny

Číslo patentu: E 10157

Dátum: 23.07.2004

Autor: Helleday Thomas

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Predložený vynález sa týka použitia látky, ktorá inhibuje aktivitu enzýmu, sprostredkujúceho opravu poškodení reťazca DNA, pri liečbe určitých foriem rakoviny, najmä rakoviny prsníkov.0002 Zistilo sa, že homologická rekombinácia (HR) zohráva dôležitú úlohu pri oprave poškodenia. ku ktorému dochádza na replikačných vídliciach DNA v bunkách cicavcov (2). Bunky s deñcienciou HR majú spomalený rast avyznačujú sa vyššou hladinou genetickej nestability. Predpokladá sa, že genetická nestabilita kvôli poklesu HR opráv v prípade rakovín u ľudí výrazne prispieva k rozvoju rakoviny v takýchto bunkách (1).0003 Post-transkripčné modifikácie nukleárnych proteínov poly(ADP-ribozyI)áciou (PARP) ako odpoveď na poškodenie DNA reťazca zohráva dôležitú úlohu pri oprave DNA, regulácii apoptózy a zachovaní stability genómu.0004 PoIy(ADP-ríbózo)polymeráza (PARP-1) je hojne sa vyskytujúci nukieárny proteín v cicavčlch bunkách,ktorý katalyzuje tvorbu poly(ADP-ribózo) (PAR) polymérov s použitím NAD ako substrátu. Pri poškodení DNA sa PARP-1 rýchlo viaže na miesto poškodenia na DNA reťazci (jednoduchý reťazec alebo dvojitý reťazec) a katalyzuje adíciu negatívne nabitých reťazcov PAR na seba navzájom (automodifikácia) alebo na iné proteíny(pozri odkazy 3, 4). Predpokladá sa, že väzba PARP-1 na miesta poškodenia DNA chráni DNA pred dalšími poškodeniamí až do oddelenia PARP-1 od miesta poškodenia akumulovaným negatívnym nábojom pochádzajúcím z PAR polymérov (5,6).0005 Hoci PARP-1 sa zúčastňuje niekoľkých bunkových procesov, ako je napríklad modulácia štruktúry chromatínu, replikácia DNA, opravy a transkripcia DNA, PARP-1 knockoutované myši sa vyvíjajú normálne (7). Bunky izolovane z týchto myší sa vyznačujú hyper rekombinačným fenotypom a genetickou nestabllitou vo forme zvýšených hladín SCE, mikronukleov a tetraploídov (8-10). U týchto PARP-1 knockoutovaných myší tiež môže dochádzať ku genetickej nestabilite skrátením telomérov, zvýšenou frekvenciou fúzie chromozómov a vznikom aneuploídov (11), aj keď ani jeden z týchto dôsledkov sa nemôže opakovat v ďalšej sade PARP-1 knockoutovaných myší (12). U predchádzajúcich knockoutovaných myší, záchrana PARP-1 nulovou mutáciou narušila V(D) J rekombínáciu u myší SCID (13). Tieto výsledky podporujú predpoklad Lindahla a jeho spolupracovníkov, že PARP-1 má funkciu ochrany pred rekombináciou (5). Predpokladajú, že viazanie PARP 1 na miesta poškodenia DNA reťazcov zabraňuje rekombinačnému procesu rozpoznávat a spracovávať poškodenia DNA. alebo alternatívne, že negatívne náboje akumulované po poIy-ADP-ribozylácii odpudzujú susediace rekomblnogénne sekvencie DNA. Len druhý model zodpovedá inhibícii samotnej PARP-1 a exprimácii dominantnej negatívnej mutantnej PARP-1, indukujúcej SCE, ampliñkáciu génov a homologickú rekombináciu (HR 14 r 18), 0006 Štúdie založené na pôsobení inhibítorov PARP na bunky, alebo na bunkách pochádzajúcich z PARP-1 alebo PARP-2 knockoutovaných myší ukazujú, že supresla aktivity PARP-1 zvyšuje náohylnost buniek na látky poškodzujúce DNA a inhibuje opätovné spojenie porušenýoh reťazcov (3, 4, 8-11, 19, 20, 47).0007 lnhibltory aktivity PARP-1 sa používajú v kombinácii s bežnými protlrakovinovými látkami, ako sú napríklad rádioterapia a chemoterapia (21). inhibítory sa použili vkombinácii s metylujúoimi látkami, topoizomerázovými jedmi a ionizačným žiarením a zistilo sa, že zlepšujú účinnosť týchto foriem liečby. Je však známe, že takýto spôsob liečby spôsobuje poškodenie a smrt nerakovinových alebo zdravých buniek a je spojený s nepríjemnými vedlajšlmi účinkami.0008 Existuje teda potreba liečby rakoviny, ktorá je efektívna a zároveň selektivna pri usmrcovaní rakovinových buniek, a ktorá nemusí byt podávaná v kombinácii s ožarovacou liečbou alebo chemoterapíou. 0009 Autori predloženého vynálezu prekvapivo zistili, že bunky s deñcienciou homologickej rekombínácie(HR) sú hypersenzitívne na inhibítory PARP v porovnaní s bunkami divokého typu. To je prekvapujúce, pretože PARP-1 knockoutované myši žijú normálne, čo naznačuje, že PARP-1 nie je pre život nenahraditelná. Nemožno teda očakávať, že by bunky boli senzitlvne na lnhibíciu PARP.0010 Podľa prvého aspektu vynálezu sa poskytuje použitie látky, ktorá inhibuje aktivitu enzýmu, ktorý sprostredkuje opravu poškodení reťazca DNA, na výrobu lieku na liečenie ochorení, ktoré sú spôsobené genetickým defektom v géne, ktorý sprostredkuje homologickú rekombináciu.0011 V ďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob liečby ochorenia alebo stavu u cicavcov, vrátane človeka,ktoré je spôsobené genetickým defektom v géne, ktorý sprostredkuje homologickú rekomblnáciu, pričom tento spôsob zahrnuje podávanie terapeuticky účinného množstva látky, ktorá inhibuje aktivitu enzýmu sprostredkujúceho opravy poškodení reťazcov DNA alebo iných poškodení na mieste replikácíe, cicavcovi. 0012 Pri výhodnom uskutočnení je uvedeným enzýmom PARP. V ďalšom výhodnom aspekteje uvedenou látkou inhibítor PARP alebo molekula RNAi špecifická k PARP genu.0013 V ďalšom aspekte je použitím liečenie rakoviny.0014 Výhodne je liekom farmaceutický prostriedok, obsahujúci inhibítor PARP v kombinácii s farmaceutický prijatelnm nosičom alebo riediacim činidlom.0015 pecíñcká senzitivita nádorov s deticienciou HR na inhibíciu PARP-1 znamená, že normálne sa deliace bunky u pacienta nebudú Iiečením ovplyvnené. Liečenie rakovinových buniek s deficienciou HR s použitím inhibítora PARP má tiež tú výhodu, že sa nemusí podávať ako kombinačná terapia spolu s bežnými ožarovaclmi liečbami alebo chemoterapiou, čím sa predíde vedľajším účinkom, súvisiacim s týmito bežnými formami liečby.0016 Genetický defekt v géne, ktorý sprostredkuje homologickú rekombináciu, môže byt spôsobený mutáciou v géne kódujúcom proteín zúčastňujúci sa HR, jeho absencíou alebo chybnou exprimáciou.-2 0017 Vdalšom aspekte vynález ďalej poskytuje použitie inhibítora PARP na výrobu lieku na indukovanie apoptózy v bunkách s HR defektom.0018 Vďalšom aspekte vynález poskytuje spôsob indukovania apoptozy sbunkách sHR defektom u cicavcov, pričom tento spôsob zahrnuje podávanie terapeuticky účinného množstva inhibítora PARP cicavcovi. 0019 Vyvolanim apoptózy v bunkách s HR defektom by sa malo umožnit redukovanie alebo spomalenie rastu nádorov u cicavcov.0020 Bunkami s HR defektom sú výhodne rakovinové bunky.0021 Rakovinové bunky s HR defektom môžu mat čiastočnú alebo úplnú deficienciu HR. Výhodne majú rakovinové bunky úplnú deficienciu HR.0022 Výraz .,rakovina alebo nádod zahrnuje rakovinu pľúc, hrubého čreva, pankreasu, žalúdka, vaječníkov,maternice, prsníkov alebo prostaty. Rakovina tiež môže zahrnovat rakovinu kože. obličiek, pečene, žlčníka alebo mozgu. Rakovina je výhodne u cicavca, výhodne človeka.0023 Rakovinou, ktorá sa má liečiť, môže byt dedičná forma rakoviny, kde má líečený pacient rodinnú predispoziciu na rakovinu. Výhodne je liečenou rakovinou dedičná rakovina súvisiaca s génmi. Pri výhodnom uskutočnení vynálezu je dedičnou rakovinou súvisiacou s génmi rakovina prsníkov.0024 Pri výhodnom aspekte je inhibítor PARP užitočný pri liečbe rakovinových buniek s defektom v exprimácii génu zúčastñujúceho sa HR. Gény s predpokladanou funkciou v HR zahrnujú XRCC 1. ADPRT(PARP-1), ADPRTL 2 (PARP-2), CTPS, RPA, RPA 1, RPA 2, RPAS, XPD, ERCC 1, XPF, MMS 19, RAD 51,RAD 51 B, RAD 51 C, RAD 51 D, DMC 1, XRCC 2, XRCC 3, BRCA 1, BRCA 2, RAD 52, RAD 54, RAD 50, MRE 11,NBS 1, WRN, BLM, Ku 70, Ku 80, ATM, ATR, chk 1, chk 2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD 1, FANCD 2,FANCE, FANCF, FANCG, RAD 1, RADQ, FEN-1, Mus 81. Eme 1, DDS 1, BARD (pozri odkazy (2, 3, 5, 22-28. 0025 Génom zúčastňujúcim sa HR môže byt gén potlačujúci rast nádorov. Vynález teda poskytuje liečbu rakovinových buniek s defektom v exprimácii génu potlačujúceho rast nádoru. Génom potlačujúcim rast nádoru je výhodne BRCA 1 alebo BRCA 2.0026 Rakovina prsníkov je dnes najčastejším rakovinovým ochorením u žien vzápadnom svete. Niektoré rodiny majú silnú predispozídu pre rakovinu prsnikov, čo je často spôsobené zdedenou mutáciou vjednej alele bud BRCA 1 alebo BRCA 2. Títo pacienti však stále majú jednu funkčnú alelu. Preto sa tieto pacientky vyvljajú normálne a nemajú žiadne fenotypové prejavy tejto mutácie. Vjednej bunke sa však môže funkčná alela stratiť, čím sa tato bunka stáva rakovinovou a zároveň má deficienciu homologickej rekombinácie (HR). Tento krok je rozhodujúci pri nástupe rakoviny (1).0027 Autori predloženého vynálezu sprekvapením zistili, že bunky sdeñcienciou BRCA 2 sú 100-krát senzitívnejšie na cytotoxicitu inhibítora PARP, NU 1025, ako bunky divokého typu.0028 Vo výhodnom aspekte teda vynález poskytuje použitie inhibitora PARP na výrobu lieku na liečenie rakovinových buniek s deñcienciou HR, napríklad kvôli strate exprimácie BRCA 1 a/alebo BRCA 2.0029 Liečené rakovinové bunky môžu mat čiastočnú alebo úplnú deficienciu exprimácie BRCA 1 alebo BRCA 2. Mutácie BRCA 1 a BRCA 2 možno identifikovať s použitím multiplexových PCR techník, array techník(29, 30) alebo s použitím iných selekčných postupov známych odborníkom v danej oblasti techniky.0030 lnhibítory PARP užitočné v predloženom vynáleze môžu byt vybrané z inhibítorov PARP-1, PARP-2,PARP-3, PARP-4, tankyrázy 1 alebo tankyrázy 2 (pozri odkaz 31). Pri výhodnom uskutočnení je inhibítorom PARP užitočným v predloženom vynáleze inhibítor aktivity PARP-1.0031 lnhibítory PARP užitočné v predloženom vynáleze zahrnujú benzimidazoI-karboxamidy, chinazolín-43 Hj-ony a deriváty izochinolínu (napríklad 2-(4 ~hydroxyfenyI)benzimidazol-zi-karboxamid (NU 1085), 8-hydroxy 2-metylchinazoIín-4-3 Hón (NU 1025) 6(5 H)fenantr 1 dinón 3 aminobenzamid benzimidazol-zt-karboxamidy(BZ 1-6) a tricyklické laktám indoly (Tl 1 ~ 5) (321. Dalšie inhibltory PARP možno identiñkovat bud podľa 33 alebo novým testom FIashPIate 34.0032 inhibítor PARP vo forme farmaceutického prostriedku možno podávať akýmkoľvek účinným vhodným spôsobom, ktorý je efektívny pri zacielovaní na rakovinové bunky, okrem iného napríklad orálnym, intravenóznym, intramuskulárnym, intranazálnym alebo lokálnym podaním. Nosiče alebo riediace činidlá užitočné na použitie vo farmaceutickom prostriedku môžu okrem iného zahrnovat soIanku, pufrovanú soIanku,dextrózu, vodu, glycerol, etanol a ich kombinácie.0033 Pri liečbe alebo pri profylaxii možno aktívnu látku podávat jednotlivcovi ako injektovatelný prostriedok,napríklad ako sterilnú vodnú disperziu. inhibítor možno podávať priamo do nádoru alebo ho možno zacieľovat na nádor cez systémové podanie.0034 Terapeuticky účinným množstvom inhibitora je zvyčajne také množstvo, ktoré je dostatočné a dosiahnutie požadovaného účinku a môže sa menit v závislosti od povahy a závažnosti stavu ochorenia a potencíe inhibítora. Rozumie sa, že na profylaxiu možno použit iné koncentrácie ako na liečbu aktívneho ochorenia.0035 Na podanie cicavcom a výhodne človeku sa očakáva, že denná dávková hladina aktívnej látky je najviac 100 mg/kg, napríklad 0,01 mg/kg až 50 mg/kg telesnej hmotnosti, zvyčajne najviac 0,1, 0,5, 1,0, 2,0,5,0, 10, 15, 20 alebo 30 mg/kg telesnej hmotnosti. Množstvo podaného inhibítora a frekvencia podania však v konečnom dôsledku bude na zvážení lekára.0036 Terapeutickou výhodou použitia inhibítorov PARP pri pôsobení na rakovinové bunky je, že na dosiahnutie terapeutického účinku pri liečbe rakoviny sú potrebné len veľmi nízke dávky, čím sa znižuje nahromadenie inhibítorov v tele pacienta a súvisiace toxické účinky.0037 Výhodný aspekt vynálezu poskytuje látku, ktorá je ínhibičnou RNA (RNAi) molekulou.-3 0038 Funkcia génu sa odstráni technikou, pri ktorej sa dvojzávitnicová RNA, tiež označované ako inhíbićná RNA (RNAi), introdukuje do bunky, vdôsledku čoho dôjde k deštrukcii mRNA komplementárne k sekvencii zahrnutej v RNAi molekule. MoIekuIa RNAi obsahuje dva komplementárne reťazce RNA (sense reťazec a antisense reťazec), ktoré sú navzájom spevnené, vytvárajúc dvojzávitnicovú molekulu RNA. MoIekuIa RNAi je zvyčajne odvodené z exogénnej alebo kódovacej sekvencie génu, ktorý sa má odstrániť.0039 Uvedená molekula RNAi je výhodne odvodené z molekuly nukleovej kyseliny, vybranej zo skupiny pozostávajúcej za) sekvencie nukleovej kyseliny, ktorú predstavuje sekvencia na obrázkoch 9, 10, 11, 12, 13 alebo 14 alebo jej fragmentyb) sekvencie nukleovej kyseliny, ktorá hybridizuje k sekvencii nukleovej kyseliny z Obrázkov 9, 10, 11, 12,13 alebo 14 a kóduje gény pre PARPc) sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá zahrnuje sekvencie, ktoré sú zdegenerované v dôsledku genetického kódu k sekvenciám nukleovej kyseliny detinovanej v (a) a (b).0040 Na základe nedávnych štúdií sa predpokladá, že molekuly RNAi v rozsahu 100-1000 bp odvodené z kódovacej sekvencie sú účinnými inhibítormi exprimácie génov. Prekvapivo je na blokovanie exprimácie génov, zodpovedných za katalýzu mechanizmu, potrebných len niekoľko málo molekúl RNAi. Zdá sa, že akcia sa odohráva vjadre, keďže v cytoplazme buniek je detekovateíný len malý až nulový výskyt RNAi, čo naznačuje, že RNAi vykazuje svoj účinok počas syntézy alebo spracovania mRNA.0041 Uvedená molekula RNAi podľa predloženého vynálezu má výhodnejšie dĺžku 10 nukleotidových baz(nb) až 1000 nb. Ešte výhodnejšie má uvedená molekula RNAi dĺžku 10 nb 20 nb 30 nb 40 nb 50 nb 60 nb 70 nb 80 nb 90 nb alebo 100 bp. Ešte výhodnejšie má uvedená molekula RNAi dĺžku 21 nb.0042 Ešte výhodnejšie molekula RNAi zahrnuje sekvenciu nukleových kyselín aaa agc cau ggu gga gua uga0043 Ešte výhodnejšie molekula RNAi zahrnuje sekvenciu nukleových kyselín aag acc aau cuc ucc agu uca ac (PARP-Z)0044 Ešte výhodnejšie molekula RNAi zahrnuje sekvenciu nukleových kyselín aag acc aac auc gag aac aac0045 MoIekuIa RNAi môže zahrnovat modiñkované nukleotidové bázy.0046 Výhodné znaky každého aspektu vynálezu sú s uváženlm príslušných rozdielov rovnaké ako pri všetkých ostatných aspektoch.0047 Predložený vynález bude dalej opísaný pomocou príkladov s odvolaním sa na sprievodné obrázky, kdeObrázok 1 je graf, ktorý ukazuje, že bunky sdeñcienciou HR sú hypersenzitívne na toxické účinky spôsobené inhibíciou PARP-1. Rast vedľajších kolónii bunkových línií čínskeho škrečka AAB (divoký typ), irs 1 SF (s deficienciou HR 4), CXR 3 (irs 1 SF komplementovaný s XRCC 3 2), V 79 (divoký typ), irs 1(s deficienciou HR 5) alebo irs 1 X 2.2 (irs 1 komplementovaný s XRCC 2 1) pri vystvení 3-AB (A), ISQ (B) alebo NU 1025 (C). Znázornené sú priemery (symboly) a štandardné odchýlky (stĺpce) minimálne troch experimentov. Použil sa test rastu vedľajších kolónilObrázok 2 je graf, znázorñujúci prežívanie buniek v prítomnosti inhibítora PARP NU 1025 v bunkách wt V 79, bunkách VC-8 s deficienciou BRCA 2 a bunkách VC-B komplementovaných sfunkčným génom BRCA 2 (VC-813, VC-8 B 2). Použil sa test rastu vedľajších kolóniiObrázok 3 je histogram, znázorñujúcí percentuálny podiel buniek v apoptóze po 72-hodinovej inkubácii s NU 1025Obrázok 4. (a) Analýza western blot protelnových lyzátov izolovaných z prsnych rakovinových buniek MCF-r (pssm) alebo MDA-MB-231 (p 53 mm) po 48-hodinovej transfekcii s siRNA. (b) Rast vedľajších kolónií buniek MCF-7, na ktoré sa pôsobilo s siRNA alebo (c) bunky MDAMB-231 po vystavení inhibítoru PARP, NU 1025. Znázornené sú priemew (symboly) a štandardné odchýlky (stlpce) najmenej troch experimentov.Obrazok 5. Bunky s deficienciou BRCA 2 neopravujú rekombinančné poškodenie vytvorené na mieste replikácie inhibítormi PARP.(a) Vizualizácia miest poškodení dvojzàvitnice (DSBs) v bunkách s proficienciou alebo deficienciou BRCA 2 po 24-hodinovom pôsobení s NU 1025 (0,1 mM) pulznou gélovou elektroforézou. Hydroxymočovina 2 mM sa použila ako pozitívna kontrola. (b) Vizualizácia zdrojov ohnlsk vH 2 A× v neošetrených bunkách V-C 8 B 2 a V-C 8. Počet buniek, obsahujúcich zdroje ohnísk vH 2 A× (c) alebo zdroje RAD 51 (d) vizualizovaných v bunkách V-C 8 B 2 a V-C 8 po 24 ~hodinovom pôsobení s NU 1025 (10 M). Znázornené sú priemery (symboly) a štandardné chyby (stlpce) troch až deviatich experimentov. (e) Navrhnutý model smrti buniek índukovanej v bunkách s deñcienciou BRCA 2.-4 Obrázok 6. PARP-1 a nie PARP-2 je dôležitá pri prevencii tvorby rekombinogénnych poškodení,vyvolávajúcidn smrt pri absencii BRCAZ. (a) RT-PCR na RNA izolovanej z buniek SW 480 SN.3 osetrovaných s BRCAZ, PARP-1 a PARP-2 siRNA v znázornených kombináciách po dobu 48 hodín. (b) Klonogénne prežívanie po 48-hodinovej deplécii BRCAZ PARP-1 a PARP-2. Znázornené sú priemery(symboly) a štandardne odchýlky (stĺpce) minimálne troch experimentov. Dve a tri hviezdičky označujú štatlstickú signifikanciu v t-teste p 0,01 a p 0.001, v uvedenom poradí. (c) Western blot pre PARP-1 v bunkách SW 480 SN.3 ošetrených s rôznymi siRNA.Obrázok 7. (a) fizualizácia PAR polymérov v neošetrených a (b) tymidínom ošetrených bunkách V 79 (5 mM po dobu 24 hodín). (c) Percentuálny podiel buniek 1 O miest PARP aktivity po pôsobení s hydroxymočovinou (0,2 mM) a tymidínom (5 mM). Pri každom ošetrení a experimente sa napočítalo najmenej 300 jadier. (d) Prežlvanie buniek V-C 8 B 2 po spoločnom pôsobení s hydroxymočovinou alebo (e) tymidínom a NU 1025 (10 M). (f) Aktivita PARP sa merala hladinou voľného NAD(P)H, po liečbe s MMS, hydroxymočovinou (0,5 mM) alebo tymidínom (10 mM). Znázornené sú priemery (symboly) a štandardné odchýlky (stlpce) minimálne troch experimentov.Obrázok 8. (a) Vizualizácia PAR polymérov v neošetrených bunkách V-C 8 a (b) bunkách V-C 8 B 2. (c) Kvantifikácia percentuálneho podielu buniek obsahujúcich 1 O miest aktivity PARP v neošetrených bunkách V-CB a bunkách V-C 8 B 2. (d) Hladina NAD(P)H meraná s neošetrených bunkách V-C 8 a bunkách V-C 8 B 2. Tri hviezdičky označujú p 0,001 v t-teste. (e) Vizualizácia RAD 51 a miest PARP aktivity v bunkách V 79 po 24-hodinovom pôsobení tymidínom (5 mM). (f) Model úlohy PARP a HR na zastavených replikačných vidliciach.Obrázok 9 je ľudskou cDNA sekvenciou PARP-1 Obrázok 10 je ľudskou cDNA sekvenciou PARP-2 Obrázok 11 je ľudskou cDNA sekvenciou PARP-3 Obrazok 12 je ľudskou gDNA sekvenciou Tankyráza 1 Obrázok 13 je ľudskou mRNA sekvenciou Tankyráza 2Obrázok 14 je ľudskou mRNA sekvenciou VPARP.Cytotoxicíta inhibítorov PARP na bunky s HR defektom XRCCZ XRCC 3 alebo BRCAZ0048 Bunkové línie irs 1, irs 1 X 2.1 a V 79-4 boli darom od Johna Thackera 40 a punkové línie AAB, irs 1 SF a CXR 3 poskytol Larry Thompson (411.0049 VC-B, VC-8 B 2, VC-813 boli darom od Malgorzaty Zdzienickej (421. Všetky bunkové linie s tejto štúdii boli kultivované v Dulbeccovom modiñkovanom Eagleovom médiu (DMEM) s 10 fetálnym bovínnym sérom a penicilínom (100 U/ml) a streptomycín sulfátom (100 g/ml) pri 37 °C v atmosfére obsahujúcej 5 C 02.Test na toxicitu - test rastu vedľajších kolónií0050 500 buniek suspendovaných vmédiu sa naplátovalo na Petriho misky 4 hodiny pred pridaním 3-AB,ISQ alebo NU 1025. ISQ a NU 1025 sa rozpustili v DMSO na konečnú koncentráciu 0,2 vošetrovacom médiu. Po 7 až 12 dňoch. ked už bolo možné pozorovat kolónie, sa tietokolónie zafixovali a zafarbili s metylenovou modrou v metanole (4 g/l). Potom sa spočítali kolónie pozostávajúca z viac ako 50 buniek.0051 0,25 x 10 ° buniek sa naplátovalo na Petriho misky a kultivovalo po dobu 4 hodin pred ošetrením s NU 1025. Po 72 hodinách sa bunky trypsinizovali a resuspendovali s médiom obsahujúcim akékoľvek pohyblivé bunky ztejto vzorky. Bunky sa granulovali centrifugáciou a resuspendovali na analýzu apoptózy s FTFCkonjugovaným anexínom-V a propldiumjodidom (PI) (ApoTarget, Biosource International) v súlade s inštrukciami výrobcu. Vzorky sa analyzovali prietokovou cytometriou (Becton-Dickenson FACSort , 488 nm laser), a frakciou živých buniek sa určilo percento apoptických buniek (PI-negatívne) viazaných s FITCkonjugovaným anexínom-V.

MPK / Značky

MPK: C12N 15/11, A61K 38/00

Značky: aktivitu, použitie, výrobu, inhibujúcej, lieku, liečenie, rakoviny

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/32-e10157-pouzitie-rnai-inhibujucej-aktivitu-parp-na-vyrobu-lieku-na-liecenie-rakoviny.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Použitie RNAi inhibujúcej aktivitu PARP na výrobu lieku na liečenie rakoviny</a>

Podobne patenty