Inžinierstvo systémov, spôsoby a optimalizované vodiace prostriedky na manipuláciu so sekvenciami

Číslo patentu: E 20001

Dátum: 12.12.2013

Autori: Cong Le, Ran Fei, Zhang Feng, Hsu Patrick

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 Predkladaný vynález sa všeobecne týka systémov, spôsobov a kompozícii používaných na kontrolu génovej expresie zahŕňajúcich zacielenie sekvencie, ako je perturbácia genómu alebo génove editovanie, ktoré môže využívať vektorové systémy príbuzné so zoskupenými pravidelne rozmíestnenými krátkymi palindromickými repetíciami0002 Tento vynález bol realizovaný s vládnou podporou udelenou Národnými zdravotnýmiústavmi, NlH Pioneer Award DP 1 MH 100706. Vláda má určité práva k tomuto vynálezu. DOTERAJŠÍ STAV TECHNIKY0003 Nedávne pokroky v technikách sekvenovania genómu a analytických metódach výrazne zrýchlili schopnosť katalogizovať a mapovať genetické faktory spojené s rozmanitou škálou biologických funkcii a chorôb. Technológie presného zacielenia do genómu sú potrebne na to, aby umožnili systematické reverzné inžinierstvo príčinných genetických variácií tým, že umožnia selektivne zmeny (perturbáciu) jednotlivých genetických elementov,ako aj pokrok v syntetickej biológii a biotechnologických a lekárskych aplikáciách. Aj keď techniky editovania genómu, ako sú napríklad zinkové prsty (designer zinc ñngers),efektory podobné transkripčným aktivátorom (TALE) alebo navádzané (homíng) meganukleázy sú k dispozícii na produkciu cielených perturbácií genómu, zostáva potreba nových technológií cieleného pozmeňovania genómu, ktoré sú cenovo dostupné, ľahko nastaviteľné, škálovateľné a prístupné na zacielenie do viacerých polôh V rámci0004 Existuje naliehavá potreba altematívnych a robustných systémov a technik nazacielenie sekvencií so širokou škálou aplikácií. Tento vynález sa zameriava na túto potrebu aposkytuje súvisiace výhody. Systém CRISPR/CAS alebo CRISPR-Cas (oba výrazy sú V tejto patentovej prihláške navzájom zameniteľné) nevyžaduje generovanie upravených proteínov na zacielenie do špecifických sekvencií, ale skôr sa jediný enzým Cas môže naprogramovať krátkou RNA molekulou, aby rozpoznal konkrétny cieľ (target) na DNA, inými slovami enzým Cas sa môže upraviť pre konkrétny cieľ na DNA pri použití uvedenej krátkej RNA molekuly. Pridanie systému CRISPR-Cas do repertoára techník sekvenovania genómu a analytických metód môže výrazne zjednodušiť metodiku a urýchliť schopnosť katalogizovať a mapovať genetické faktory spojené s rozrnanitou škálou biologických funkcii a chorôb. Ak sa má systém CRISPR-Cas efektívne využívať na editovanie genómu bez škodlivých účinkov,je dôležité pochopiť aspektyl inžinierstva a optimalizácie týchto nástrojov upravujúcichgenóm, ktoré sú aspektmi predkladaného vynálezu.0005 Predmetným vynálezom sa tu predkladá zkonstruovaný přirozeně se nevyskytující Vektor CRISPR-Cas podle nároku 1. Další aspekty vynálezu jsou uvedeny vzávislýchnárocích. Ve vynálezu se rovněž předkládá použití systému podle nároků 19 a 20.0006 V jednom aspekte tento vynález opisuje vektorový systém zahŕňajúci jeden alebo viac vektorov. V niektorých uskutočneníach systém zahŕňa (a) prvý regulačný element funkčne pripojený na párovú sekvenciu tracr a jedno alebo viac inzerčných miest na vloženie jednej alebo viacerých vodiacich sekvencií (guide sequences) pred párovú sekvenciu tracr, kde pri expresii vodiacej sekvencíe riadi sekvenčne špecifické naviazanie komplexu CRISPR na cieľovú sekvenciu v bunke, napríklad v eukaryotickej bunke, pričom komplex CRISPR sa skladá z enzýmu CRISPR v komplexe s (l) vodiacou sekvenciou, ktorá hybridizuje s cieľovou sekvenciou, a (2) párovou sekvenciou tracr, ktorá hybridizuje so sekvenciou tracr a(b) druhý regulačný element funkčne pripojený na sekvenciu kódujúcu uvedený enzým CRISPR zahŕňajúci jadrovú lokalizačnú sekvenciu (NLS) pričom komponenty (a) a (b) sú umiestnené na rovnakých alebo rôznych vektoroch systému. V niektorých uskutočneníach komponent (a) ďalej zahŕňa sekvenciu tracr nasledujúcu za párovou sekvenciou tracr pod kontrolou prvého regulačného elementu. V niektorých uskutočneníach komponent (a) ďalej zahŕňa dve alebo viac vodiacich sekvencií funkčne pripojených na prvý regulačný element,pričom pri expresii každej z dvoch alebo viacerých vodiacich sekvencií riadi sekvenčne špecifické naviazanie komplexu CRISPR na inú cieľovú sekvenciu v eukaryotickej bunke. V niektorých uskutočneníach sa systém skladá zo sekvencíe tracr pod kontrolou tretiehoregulačného elementu, ako je napríklad promótor polymerázy III. V niektorýchuskutočneníach sa sekvencia tracr vyznačuje aspoň 50 , 60 , 70 , 80 , 90 , 95 alebo 99 sekvenčnou komplementaritou v celej dĺžke párovej sekvencie tracr, pokiaľ sú optimálne zarovnané. V niektorých uskutočneníach sa komplex CRISPR skladá z jednej alebo viacerých jadrových lokalizačných sekvencií s dostatočnou silou tak, aby riadili akumuláciu uvedeného komplexu CRISPR v zistiteľnom množstve V jadre eukaryotickej bunky. Bez toho,aby si autori želali viazať sa na akúkoľvek teóriu sa predpokladá, že jadrová lokalizačná sekvencia nie je nutná pre činnosť komplexu CRISPR v eukaryotoch, ale zahrnutie takýchto sekvencií zvyšuje aktivitu systému, najmä pokiaľ ide o zacielenie molekúl nukleovej kyseliny do jadra. V niektorých uskutočneníach je enzýmom CRISPR enzým systému CRISPR typu II. V niektorých uskutočneníach je enzýmom CRISPR enzým Cas 9. V niektorých uskutočneníach je enzýmom Cas 9 enzým Cas 9 z S. pneumoníae, S. pyogenes alebo S. thermophílus a môže zahŕňať mutovaný Cas 9 odvodený z týchto organizmov. Enzýmom môže byť homológ alebo ortológ Cas 9. V niektorých uskutočneníach je enzým CRISPR kodónovo optimalizovaný (codon-optimized) na expresiu V eukaryotickej bunke. V niektorých uskutočneníach enzým CRISPR riadi štiepenie jedného alebo dvoch reťazcov V mieste cieľovej sekvencie. V niektorých uskutočneníach enzýmu CRISPR chýba aktivita na štiepenie DNA reťazca. V niektorých uskutočneníach je prvým regulačným elementom promótor polymerázy III. V niektorých uskutočneníach je druhým regulačným elementom promótor polymerázy II. V niektorých uskutočneníach má Vodiaca sekvencia dĺžku aspoň 15,16, 17, 18, 19, 20, 25 nukleotidov, alebo medzi 10 až 30, alebo medzi 15 až 25, alebo medzi 15 až 20 nukleotidmi. V tomto opise všeobecne platí, že výraz Vektor sa vzťahuje na molekulu nukleovej kyseliny schopnú transportovať inú nukleovú kyselinu, ktorá na ňu bola pripojená. Vektory zahŕňajú, ale bez toho, aby na ne boli obmedzené, molekuly nukleových kyselín, ktoré sú jednoreťazcové, dvojreťazcové alebo čiastočne dvojreťazcové molekuly nukleových kyselín, ktoré obsahujú jeden alebo viac voľných koncov, žiadne voľné konce(napríklad kruhové molekuly) molekuly nukleovej kyseliny, ktoré obsahujú DNA, RNA alebo obe a ďalšie druhy polynukleotidov známych v tejto oblasti. Jedným typom vektora je plazmid, ktorý sa vzťahuje na kruhovú dvojreťazcovú DNA slučku, do ktorej sa môžu vložiť ďalšie segmenty DNA, napríklad štandardnými technikami molekulárneho klonovania. Ďalším typom vektora je vírusový Vektor, v ktorom sú sekvencie DNA alebo RNA odvodené z vírusu prítomné vo vektore umožňujúcom balenie do vírusových častíc (napríklad retrovírusy, replikačne defektné retrovírusy, adenovírusy, replikačne defektné adenovírusy aadeno-asociované vírusy). Vírusové vektory zahŕňajú aj polynukleotidy prenášane vírusom natransfekciu do hostiteľskej bunky. Niektoré vektory sú schopné autonómnej replikácie v hostiteľskej bunke, do ktorej sú zavedené (napríklad bakteriálne vektory, ktore majú bakteriálny počiatok replikácie a epizomálne cicavčie vektory). Iné vektory (napriklad neepizomálne cicavčie vektory) sú integrované do genómu hostiteľskej bunky po zavedení do hostiteľskej bunky, a tým sú replikované spolu s hostiteľským genómom. Okrem toho niektore vektory sú schopné riadiť expresiu génov, na ktoré sú funkčne pripojené. Takéto vektory sa Vtomto dokumente označujú ako expresné vektory. Bežné expresné vektorypoužiteľné pri technikách rekombinantnej DNA sú často vo forme plazmidov.0007 Rekombinantné expresné vektory môžu zahŕňať nukleovú kyselinu podľa výnalezu vo forme vhodnej na jej expresiu v hostiteľskej bunke, čo znamená, že rekombinantné expresné vektory obsahujú jeden alebo viac regulačných elementov, ktoré sa môžu vybrať na základe hostiteľských buniek použitých na expresiu, ktoré sú ñąnkčne pripojené na sekvenciu nukleovej kyseliny, ktorá má byť exprimovaná. V rámci rekombinantného expresného vektora výraz funkčne pripojená znamená, že nukleotidová sekvencia, o ktorú je záujem, je spojená s regulačným elementom alebo elementmi, a to spôsobom, ktorý umožňuje expresiu nukleotidovej sekvencie (napríklad v in vitro transkripčnom/translačnom systéme alebo vhostiteľskej bunke, ked je Vektor zavedený do hostiteľskej bunky).0008 Výraz regulačný element zahŕňa promótory, zosilňovače, vnútomé ribozomálne vstupné miesta (IRES) a iné elementy na kontrolu expresie (napríklad signály na ukončenie transkripcie, ako sú polyadenylačné signály a poly-U sekvencie). Takéto regulačná elementy sa opisujú napríklad v Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Regulačné elementy zahŕňajú tie, ktoré riadia konštitutívnu expresiu nukleotidovej sekvencie v mnohých typoch hostiteľských buniek, a tie, ktoré riadia expresiu nukleotidovej sekvencie len v určitých hostiteľských bunkách (napríklad regulačné sekvencie špecifické pre tkanivo). Promótor špecifický pre tkanivo môže riadiť expresiu predovšetkým v požadovanom tkanive, ako je napríklad sval, neurón, kosť, koža, krv, špecifický orgán (napríklad pečeň, pankreas), alebo v určitých bunkových typoch (napríklad V lymfocytoch). Regulačné elementy môžu riadiť expresiu aj spôsobom závislým od času, ako napríklad spôsobom závislým od bunkového cyklu alebo od vývojového štádia, ktorý tiež môže byť alebo nemusí byť závislý od tkaniva alebo od bunky. V niektorých uskutočneniach Vektor zahŕňa jeden alebo viac promótorov PolIII (napríklad 1, 2, 3, 4, 5 alebo viac promótorov Pol III), jeden alebo viac promótorov Pol II

MPK / Značky

MPK: C12N 15/63

Značky: sekvenciami, inžinierstvo, manipuláciu, spôsoby, optimalizované, systémov, prostriedky, vodiace

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/314-e20001-inzinierstvo-systemov-sposoby-a-optimalizovane-vodiace-prostriedky-na-manipulaciu-so-sekvenciami.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Inžinierstvo systémov, spôsoby a optimalizované vodiace prostriedky na manipuláciu so sekvenciami</a>

Podobne patenty