Spôsob diagnostiky alebo detekcie konformačného ochorenia, testovanie markera konformačného ochorenia, diagnostický kit a zariadenie na vykonávanie tohto spôsobu

Číslo patentu: 287768

Dátum: 17.08.2011

Autori: Soto Jara Claudio, Saborio Gabriella

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný spôsob diagnostiky alebo detekcie konformačných ochorení prostredníctvom testovania markera (patogénneho konformera) takýchto ochorení vo vzorke, ktorý spočíva v cyklickom amplifikačnom systéme na zvýšenie úrovne patogénneho konformera, ktorý spôsobuje takéto ochorenia. Konkrétne môžu byť takýmito prenosnými konformačnými ochoreniami priónové encefalopatie. Ďalej sú opísané testy, diagnostické kity a zariadenie založené na takomto spôsobe.

Text

Pozerať všetko

Predložený vynález sa týka spôsobu diagnostiky a detekcíe konforrnačných ochorení testovaním markera(t. j. patogénneho konforrnera) takýchto ochorení vo vzorke, ktorý zahŕňa cyklický amplifikačný systém na zvýšenie hladín patogénneho konformera. Takýrnito konformačnými ochoreniami môžu byt najmä priónové encefalopatie.Konformačné ochorenia sú skupinou porúch, ktore zdanlivo navzájom nesúvisia, ale pozoruhodne sa podobajú svojimi klínickými príznakmi, ktoré odrážajú ich spoločné molekulové mechanizmy iniciácie a vlastného spáj ania sa, s následným ukladaním v tkanivách a poškodením tkanív.Záujem o štruktúru je spôsobený skutočnosťou, že každé z týchto rôznych ochorení je spôsobené abcrantnou konformačnou tranziciou záldadného proteínu, pre ktorú je charakteristické, že vedie k agregácii proteínov a ukladaniu v tkanivách. Medicínsky prezentácia týchto konformačných ochorení odráža tento molekulový mechanizmus, s typicky pomalým a zákerným nástupom, ked tranzícia nastáva v normálnom proteíne,alebo s neočakávanejším nástupom, keď tranzícia nastáva v nestabilnom variante proteínu. Dvoma príkladmi výnimočného významu takýchto konformačných ochorení sú prenosné spongiformné encefalopatie a Alzheimerova demencia, ktorá je ochorením hroziacim zahltením systémov zdravotníckej starostlivosti v rozvinutých krajinách (zhrnutie pozri v Carrell a ďalší, 1997).Prenosné spongifornmé encefalopatie (TSE), známe aj ako priónové ochorenia, sú skupinou neurodegeneratívnych ochorení, ktoré postíhujú ľudí a zvieratá. Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD), kuru, Gerstrnann-Straussler- Scheikerova choroba (GSS) a fatálna rodinná nespavosť (FFI) u ľudí, ako aj scrapie a hovädzia spongiformná encefalopatia (BSE) pri zvieratách sú niektoré z TSE ochorení (Prusiner, 1991).Hoci tieto ochorenia sú u ľudí relatívne zriedkavé, autority verejnej zdravotnej starostlivosti a vedecká komunita venujú pozornosť riziku prenosnosti BSE na ľudí cez potravinový reťazec (Cousens a ďalší, 1997,Bruce a ďalší, 1997).Ochorenia sa vyznačujú extrémne dlhou inkubačnou dobou, po ktorej nasleduje krátka a konštantne fatálna klinická choroba (Roos a ďalší, 1973). Doteraz nie je dostupná žiadna liečba.Kľúčovou vlastnosťou ochorenia je vytvorenie abnormálne tvarovanćho proteínu označeného ako PrPS°,ktorý je post-translačne modiñkovanou verziou normálneho proteínu, označovaného PrP (Cohén a Prusiner,1998). Chemické rozdiely na rozlíšenie medzi PrP izofomiami neboli detegovane (Stahl a ďalší, 1993) a zdá sa, že konverzia zahŕňa konformačnú zmenu, pri ktorej sa znižuje obsah ot-helixu v normálnom proteíne a množstvo B-skladaného listu sa zvyšuje (Pan a ďalší, 1993). Po štrukturálnych zmenách nasledujú zmeny v biochemických vlastnostiach PrP° je rozpustný v nedenaturujúcich detergentoch, PIPS je nerozpustný PrP sa ľahko štíepi proteázamí, zatiaľ čo PrP ° je čiastočne rezistentný, čoho výsledkom je vytváranie fragmentu skráteného na N-konci, známeho ako PrPres (Baldwin a ďalší, 1995 Cohén a Prusiner, 1998), PrP 27-30 formy (27-30 kDa) alebo PK- rezístent formy (rezistentný proti proteináze K).V súčasnosti neexistuje presná diagnostika TSE (WHO Report, 1998, Búdka a ďalší, 1995, Weber a ďalší, 1997). Pokusy o vývoj diagnostického testu pre priónové ochorenia sú brzdené zdanlivým chýbaním imunitnej odpovede na PrPsC. Klinická diagnostika CJD je v súčasnosti založená na kombinácii subakútnej progresívnej demencie (nvajúcej kratšie ako 2 roky), myoklonie a multifokálnej neurologickej dysfunkcii,Spojenej s Charakteristickým periodickým elektroencefalogramom (EEG) (WHO Report, 1998, Weber a ďalší, 1997). Ale variantná CJD (vCJD), väčšina iatrogénnych foriem CJD a až 40 sporadických prípadov nemá EEG abnorrnality (Steinhoff a ďalší, 1996). Priemerná presnosť klinickej diagnostiky je približne 60 pre CJD a je veľmi variabilná pre iné ochorenia súvisiace s priónmi. Klinická diagnostika je presnejšia len v neskorom štádiu ochorenia, keď sa vyvinú jasné symptómy (Weber a ďalší, 1997).Genetická analýza je užitočná pre diagnostiku vrodených príónových ochorení, ale tieto predstavujú len 15 prípadov. Neurologické zobrazovanie je užitočné len na vylúčenie iných stavov rýchlej progresívnej demencie spôsobenej štrukturálnymi léziarnj mozgu (Webera ďalší, 1997). Zistenia získané zobrazovaním mozgu prostredníctvom počítačovej tomografie (CT) a magnetické rezonančné zobrazovanie (MRI) závisia najmä od štádia ochorenia. CT je oveľa menej citlivé a v skorej fáze nedeteguje žiadnu atroñu u 80 prípadov (Galvez a Cartier, 1983). Olaem atroñe boli MRI hyperintenzívne signály detegované v bazálnych gangliách (Onofrji a ďalší, 1993). Podobne ako zmeny pozorované prostredníctvom CT, tieto zmeny nie sú v žiadnom prípade špecifické.Súčasné údaje identiñkovali niekoľko neuronálnych, astrocytových a gliových proteínov, ktoré sú zvýšené pri CJD (Jimi a ďalší, 1992). Protein S-100, neurónový špecifický izocnzýrn, a ubiquitín sú význarrme zvýšené V cerebrospinálnej tekutíne (CSF) v skorej fáze ochorenia, pričom koncentrácie klesajú v priebehu ochorenia (Jimi a ďalší, 1992). Marker neuronálnej smrti, 14-3-3 proteín, bol navrhnutý ako špecifický a cit 10livý test pre sporadickú CJD (Hsích a ďalší, 1996). Ale nie je užitočný pre diagnostiku vCJD, a je oveľa menej špecifický pri genetických fomiách. Keďže 14-3-3 proteín sa môže nachádzať v CSF pacientov s inými stavmi, tento test nie je odporúčaný WHO ako všeobecný skríning na CJD a je vyhradený na potvrdenie klinickej diagnostiky (WHO Report, 1998).Kombináciou klinických údajov s biochemíckými markermi sa dosahuje dobrý úspech pri diagnostike. Ale podľa operačnej diagnostiky CJD V súčasnosti používanej pod európskym dohľadom, definitívna diagnóza sa stanovuje len neuropatologickýrn skúmaním a detekciou prpSC bud imunohistochernicky, histologickým blotom, alebo Westem blotom (Weber a ďalší, 1997, Búdka a ďalší, 1995).Vytváranie PrPS° nie je len najpravdepodobnejšou príčinou ochorenia, ale je aj najznámejším markerom. Detekcia PrPS° v tkanivách a bunkách značne koreluje s ochorením a prítomnosťou TSE ínfektívity a liečba,ktorá inaktivuje alebo eliminuje TSE infektivitu eliminuje aj PrPS° (Prusiner, 1991). Identifikácia PrPS° v ľudských alebo zvieracích tkanívách sa považuje za kľúčovú pre TSE diagnostiku (WHO Report, 1998). Jedným dôležitým obmedzením tohto prístupu je citlivosť, keďže množstvá PIPS sú vysoke (dostatočné na detekciu bežnými metódami) len v CNS v neskorých štádiách ochorenia. Ale demonštrovalo sa, že V skorých štádiách ochorenia existuje generalizovaná distribúcia PrPS° (v malých množstvách), najmä V lymforetikulárnom systéme (Aguzzi, 1997). V skutočnosti, prítomnosť PrPS° bola publikovaná v palatálno-tonzilárnom tkanive a v apendixe získanom od pacientov s v CDJ (Hill a ďalší, 1997). Hoci nie je známe, ako skoro V priebehu ochorenia by sa mohla vo v CJD diagnostike použit biopsia mandlí alebo apendixu, ukázalo sa, že pri ovciach, ktoré sú geneticky náchylné na scrapie, môže byť PrPsc detegovaný v tkanive mandlí predsymptomaticky a v skorých štádiách inkubačnej doby. Ale PrPS° doteraz nebol v týchto tkanivách detegovaný v žiadnom z prípadov sporadíekej CJD alebo GSS (Kawashima a ďalší, 1997).Normálny proteín sa exprimuje v bielych krvinkách a V krvných doštičkách a preto je možné, že niektoré krvné bunky môžu obsahovať PrPS° v postihnutých jedincoch (Aguzzi, 1997). Z toho vyplýva možnosť krvného testu pre CJD, ale vyžadovalo by to test s oveľa vyšším stupňom citlivosti, ako majú v súčasnosti dostupné testy.Priónová replikácia hypoteticky nastáva, ked PrPS° v inñkovanom ínokule špecificky interaguje s hostiteľským PrP°, pričom katalyzuje jeho konverziu na patogénnu formu proteínu (Cohen a ďalší, 1994). Tento proces trvá mnoho mesiacov až rokov, kým sa dosiahne dostatočné PrPS° koncentrácia na spustenie klinických syrnptómov.Infekčnou jednotkou PrPS° sa zdá byť oligomérna štruktúra bohatá na B-skladaný list, ktorá konvertuje normálny proteín prostredníctvom integrácie do rastúceho agregátu (obrázok 1). Konverzia bola napodobená in vitro miešaním puriñkovaného PrP° s SO-násobným molámym nadbytkom predtým denaturovaného PrPS°Doteraz opísané in vitro konverzné systémy mali nízku účirmosť, keďže potrebovali nadbytok PrPSŽ a preto nie sú užitočné na diagnostické účely, keďže nemôžu monitorovať nedetegovateľné množstvá markeru. Dôvodom nízkej účinnosti je to, že počet PrPS° oligomérov (konvertujúcich jednotiek) ostáva v priebehu testu stály. Konvertujúce jednotky rastú postupne a nakoniec sú väčšie, ale ich počet sa nezvyšuje (obrázok 1).Podstatou vynálezu je spôsob diagnostiky alebo detekcie konforrnačných ochorení, ktoré sú charakteristické konforrnačnou tranzíciou základného proteínu medzi nepatogénnym a patogénnym konformerom, prostredníctvom testovania markera uvedeného ochorenia vo vzorke, pričom tento spôsob zahŕňa(i) uvedenie vzorky do kontaktu s určitým rrmožstvom nepatogénneho konfonnera(ii) rozrušenie agregátov, ktoré sa eventuálne vytvorili v priebehu kroku (i) a(iii) determináciu prítomnosti a/alebo množstva patogénneho konfonnera vo vzorke.Vo všeobecnosti bude patogénnym konforrnerom marker prítomnosti uvedeného ochorenia.Krok (i) výhodne zahŕňa krok (ia), ktorým je inkubovanie vzorky/nepatogénneho konformera.Podľa výhodného uskutočnenia vynálezu laoky (ia) a (ii) tvoria cyklus, ktorý sa opakuje najmenej dvakrát pred uskutočnením kroku (iii). Výhodnej šie sa cykly opakujú 5 až 40-krát, a najvýhodnejšie 5 až 20-krát.Konformačnými ochoreniami, ktoré sa majú detegovat alebo diagnostikovať, sú také ochorenia, ktoré sa vyznačujú konformačnou tranzíciou základného proteínu. Tento ,základný proteín je proteín, ktorý je schopný zaujať nepatogénnu konfomiáciu a patogénnu konfomiáciu. Jedným príkladom takéhoto proteínu je priónový proteín PrP, Ďalším príkladom takéhoto proteínu je proteín podieľajúci sa na Alzheimerovej chorobe, t. j. amyloidný proteín.Konformačnými ochoreniami, ktoré sa majú diagnostikovať alebo detegovať, sú výhodne prenosné konformačné ochorenia, ako napríklad TSE (ako sú definované v časti Doteraj ší stav techniky).V prípade diagnostiky TSE a podľa výhodného uskutočnenia vynálezu je markerom ochorenia, ako aj patogénnym konformerom, PrPSŽ zatiaľ čo nepatogénnym konfonnerom proteínu, o ktorý je záujem, je PrP°.Množstvo nepatogénneho konformera, ktoré sa používa v kroku (i) (a voliteľne v kroku (ib bude vo všeobecnosti známe, hoci nemusí byť, ak je cieľom len stanoviť prítomnosť alebo nepritomnosť patogénneho konformera.Výhodne bude nmožstvo nepatogénneho konformera, ktoré sa používa v kroku (i) (a voliteľne v kroku(ib nadbytočné nmožstvo. Vo všeobecnosti bude začiatočný pomer nepatogćnneho konformera ku patogénnemu konforrneru (ak sa nachádza vo vzorke) vyšší ako 100 l, výhodnejšie vyšší ako 1 000 1 a najvýhodnejšie vyšší ako l 000 000 l.V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu sa nepatogénny konforrner v kroku (i) nachádza v mozgovom homogenáte zdravého subjektu a/alebo sa k nemu môže pridávať pred uskutočnením kroku (i) v takom prípade sa preto mozgový homogenát obsahujúci (výhodne známy) nadbytok nepatogénneho konformera pridáva počas kroku (i). Výhodne mozgový homogenát zdravého subjektu pochádza z rovnakého druhu ako analyzovaná vzorka (napr. ľudský mozgový homogenát pre ľudskú vzorku, ktorá sa má analyzovať, potkaní mozgový homogenát pre potkaniu vzorku, ktorá sa má analyzovať). Výhodnejšie sa nepatogćnny konformer nachádza v špecifickej frakcii mozgového homogenátu, napríklad v lipidových raftoch z mozgového homogenátu. Príprava takýchto frakcií sa môže uskutočňovať, ako je opísané napriklad V Sargiacomo M a ďalší,1993.Takže vynález sa ďalej týka spôsobu alebo testu, ako je tu opísaný, pri ktorom sa tkanivo alebo tkanivová frakcia pridávajú k nepatogénnemu konforrneru v kroku (i). Výhodne je tkanivom mozgové tkanivo alebo z neho odvodený homogenát alebo frakcia, zo zdravého subjektu (t. j. subjektu, v ktorom sa nenachádza patogénny konfomrer).Bolo publikované (Kocisko a ďalší, 1994), že menej glykozylované fonny PrP° sú preferenčne konvertované na PrPS° formu. Konkrétne, PrP, na ktorý sa pôsobilo fosfatidylinozitol špeciñckou fosfolipázou C, sa rutinne účinnejšie konvertoval na patogénnu formu, ako kompletný, ťažšie glykozylovateľný PrP. Ďalšie uskutočnenie vynálezu sa preto týka spôsobu alebo testu, ako sú tu opisané, pri ktorých je nepatogénnym konfonnerom PrP, ktorý má redukovanú úroveň glykozylácie (najmä N-glykozylácie) V porovnaní so štandardným PrP°. Výhodne sa na PrP pôsobilo na účely odstránenia čiastočného, kompletného alebo významného množstva glykozylácíe pred jeho použitím ako nepatogénneho konformera v tu opísaných spôsoboch a testoch a výhodnejšie, nepatogénnym konformerom je PrP°, ktorý je v podstate neglykozylovaný.V prípade diagnostiky TSE, keď sa agregáty patogénnej formy nachádzajú vo vzorke, v priebehu kroku(i) sa bude indukovať PrP PrP° tranzicía, a v priebehu korku (ii) sa takéto agregáty budú rozdrobovať na menšie, stále účinné jednotky, z ktorých každá je ešte schopná indukovať konverziu iného PrP. Tento typ spôsobu sa tu označuje ako cyklická amplifikácia a je znázornený na obrázku 2. Výsledkom tohto systému je exponencíálny nárast nmožstva PrP, ktorý sa eventuálne nachádza vo vzorke, ktoré je možne jednoducho detegovať. V súlade s ďalším výhodným uskutočnenírn vynálezu je preto možné vypočítať množstvo PrPSŽ ktoré sa na začiatku nachádza vo vzorke, vychádzajúc zo známeho rrmožstva PrP, pričom sa determinuje nmožstvo PrPS° prítomné vo vzorke na konci testu, berúc do úvahy počet uskutočnených cyklov.Naopak, ak sa vo vzorke nenachádza žiadny PrPs° (ani sám osebe, ani vo forme agregátov), žiadna PrP molekula sa nekonvertuje na PrPS° a na konci testu bude market úplne neprítomný (žiadny patogénny konforrner sa nedeteguje vo vzorke).Ukázalo sa, že infekčnou jednotkou PrPS° je oligomér bohatý na štruktúru 3- skladaného listu, ktorý môže konvertovať normálny protein prostredníctvom integrácie do rastúceho agregátu, kde získa vlastnosti spojené s abnormálnou formou (proteázová rezistencia a nerozpustnosť) (Jarrett a Lansbury, Jr., 1993, Caughey a ďalší, 1997). Po inkubovaní týchto dvoch foriem PrP oligoméme druhy sa zväčšujú prostredníctvom regrutovania a transformovania PrPc molekúl. Tento proces má nízku účinnosť, keďže závisí od fixného počtu oligomćrov rastúcich na konci. V priebehu reakcie sa nezvyšuje počet konvertovaných jednotiek, tieto jednotky sa len zväčšujú. Predpokladá sa, že tento proces sa deje v zvieracom alebo ľudskom tele po infekcii. Je známe, že tento proces trvá mesiace alebo niekoľko rokov. V tomto vynáleze opisujeme spôsob rozdrobenia oligomérov na menšie oligoméry, pričom každý z nich je potom schopný konvertovať PrP°.Preto má tento systém priame uplatnenie pri diagnostike konfomiačných ochorení a najmä prenosných konformačných ochorení, ako napríklad TSE, prostredníctvom amplifikácie inak nedetegovateľných množstiev PrPS° v rozličných tkanivách alebo biologických tekutinách. Tento systém môže umožniť skorú identifikáciu ľudí, u ktorých je riziko vývoja TSE a mohol by byť aj veľmi užitočný na sledovanie biochemickej účinnosti TSE terapeutických zlúčenín V priebehu klinických testov.V súlade s výhodným uskutočnením vynálezu sa vzorka, ktorá sa má analyzovať, podrobi predošetrovaciemu kroku, ktorého účelom je selektívne koncentrovať patogénny konformer, ktorý sa má detegovať, vo vzorke. Bolo publikované, že v pripade TSE je tak PrP°, ako aj PrPSŽ lokalizované v špeciálnej oblasti plazmatickej membrány, ktorá je odolná proti miernemu detergenmému ošetreniu (ako napríklad proti pôsobeniu ľadovo vychladeným Tritonom X-100), vďaka relatívne vysokému obsahu cholesterolu a glykosñngolipidov(M. Vey a ďalší, 1996). Tieto membránové domény sa označujú ako lipidové rafty alebo detergent- rezistentné membrány (DRM), alebo caveolae podobné domény (CLDs) a sú bohaté na signalizačné proteíny, recep 10tory a GPI-ukotvené proteíny. Potvrdili sme, že 100 PrP v mozgu je pripojených na túto frakciu, ktorá obsahuje 2 celkových proteínov (pozri príklad 6 a obrázok 7). Takže jednoduchý krok izolácie lipídového raítu zo vzorky umožňuje dramatické obohatenie o PrP°. Podobné výsledky prihlasovateľ získal aj pri izolácii lipidových raftov zo scrapie mozgového homogenátu, pri ktorej sa PrPs° izoloval z raftov.Takže jedno uskutočnenie vynálezu zahŕňa krok, v ktorom sa vzorka, ktorá sa má analyzovať, podrobí predošetrovacíemu kroku na selektívnu koncentráciu patogénneho konfonnera vo vzorke. Výhodne je patogénnym konformerom PrPS° a predošetrením je extrakcia zo vzorky frakcie, ktorá je nerozpustná v rniernych detergentoch.Kroky (i) a (ia) sa výhodne uskutočňujú vo fyziologických podmienkach (pH, teplota a iónová sila) a výhodnejšie sa do roztoku pridávajú aj proteázové inhibítory a detergenty. Podmienky sa zvolia tak, aby umožňovali patogénnemu konformeru, ak je vo vzorke prítomný, konvertovať nepatogénny konfonner na patogénny konformer a tak vytvárať agregát alebo oligomér patogénnych konformerov. Pre priememého odborníka v oblasti budú vhodné fyziologické podmienky zrejmé.Dĺžka inkubovania bude taká, aby umožnila konvertovanie určitej, celej alebo významnej časti nepatogénneho konformera na patogénny konforrner, za predpokladu, že vzorka obsahuje nejaký patogénny konformer. Priemerný odborník v oblasti bude jednoducho schopný determinovať dĺžku inkubácie. Výhodne bude každá ínkubácía trvať l minútu až 4 hodiny, výhodnejšie 30 minút až 1 hodinu a výnimočne výhodne približne 60 minút.lnkubačný krok (ia) môže zahŕňať aj ďalší krok (ib), ktorý zahŕňa pridanie ďalšieho rrmožstva nepatogénneho konformera.Na dezintegráciu agregátov v priebehu kroku (ii) v spôsobe podľa predloženého vynálezu môžu byť použite rôzne metódy. Tieto metódy zahŕňajú pôsobenie rozpúšťadlami (ako napríklad dodecylsulfátom sodným, dimetylsulfoxídom, acetonitrilom, guanidínorn, močovinou, trifluóretanolom, zriedenou kyselinou trifluóroctovou, zriedenou kyselinou mravčou atdĺ), modífikáciu chemicko-fyzikálnych vlastností roztoku, ako napríklad pH, teploty, iónovej sily, dielektrickej konštanty, a fyzikálne metódy, ako napríldad sonifikáciu, laserové žiarenie, zrnrazovaníe/rozrnrazovanie, French stláčanie, autokávovaciu inkubáciu, vysoký tlak, miešanie, jemnú homogenizáciu, iné typy žiarenia atď. Výhodným spôsobom podľa vynálezu je sonifikácia.Dezintegrácia sa môže uskutočňovať tak dlho, až kým sa nerozpadne určitá, celá alebo významná časť agregátov, ktore sa vytvorili V priebehu kroku (ii). Nie je nevyhnutné, aby sa všetky agregáty dezíntegrovali V každom dezintegračnom kroku. Týmto spôsobom sa v každom dezintegračnom kroku zvyšuje počet konvertujúcich jednotiek.Priemerný odbomík V oblasti ľahko stanoví dezíntegračný čas a tento čas môže závisieť od použitého spôsobu dezintegrácíe. Výhodne sa dezintegrácia uskutočňuje 1 sekundu až 60 minút, výhodnejšie 5 sekúnd až 30 minút a najvýhodnejšie 5 sekúnd až 10 minút. Ak sa dezintegrácia uskutočňuje soniñkáciou, soniñkácia trvá výhodne 5 sekúnd až 5 minút a najvýhodnejšie 5 až 30 sekúnd.Soniñkácia sa v minulosti používala ako časť niekoľkých metód na puriñkáciu PrP s cieľom zvýšiť rozpustnosť veľkých agregátov, ale nikdy nebola opísaná na ampliñkácíu in vitro konverzie PrP.Použitie tradičného jedno-sondového sonifikátora je problernaticke pri spracovávaní mnohých vzoriek naraz, čo vyžaduje díagnostický test. Na trhu existujú určité soniñkátory s formátom 96-jamkových míkrotitračných platní, ktoré poskytujú sonifikáciu všetkých jamiek v rovnakom čase a môžu byť programované na automatickú činnosť. Tieto soniñkátory je možné jednoducho upraviť na použitie v diagnostickom spôsobe podľa predloženého vynálezu.Takže jedno uskutočnenie vynálezu sa týka použitia, v kroku (ii), multijamkového sonifikátora.Detekcia novo konvertovaného patogénneho konforrnera, napr. PrPSŽ (iii) po cyklickej ampliñkačnejprocedúre opísanej v krokoch (i) a (ii) by sa mohla uskutočňovať akýmkoľvek zo známych spôsobov. Špecifická detekcia PrP ° sa zvyčajne (ale nie vždy, pozri neskôr) uskutočňuje prvým krokom separácie dvoch PrP izoforiem (normálneho proteínu a patogénneho proteínu). Separácia sa uskutočňuje na základe príznačných biochemických vlastností PrPsĺ ktoré ho odlišujú od väčšiny normálnych proteínov tela, konkrétne PrPS° je čiastočne rezistentný proti pôsobeniu proteázarni a nie je rozpustný ani v prítomnosti nedenaturačných detergentov. Preto je prvým krokom po ampliñkačnej procedúre zvyčajne odstránenie alebo separácia PrP° zo vzorky, bud pôsobením proteázami, alebo cetrifugáciou, aby sa oddelil rozpustný (PrP°) od nerozpustného(PrPs°) proteínu. Preto sa detekcia PrPS° môže uskutočňovať ktoroukoľvek z nasledujúcich metód, inter alía(A) Imunobloting po SDS-PAGE. Ten sa uskutočňuje rutinným postupom, ktorý je dobre známy priemernému odborníkoví v oblasti, a použitím niektorej z mnohých komerčne dostupných anti-PrP protilátok.(B) ELISA test. Detekcia v tuhej fáze sa môže uskutočňovať bud jednoduchým testom, pri ktorom sa vzorka nanesie na platňu a potom sa deteguj e množstvo PrPS° použítím anti-PrP protilátok, alebo výhodne, použitím scndvičovej ELISA, pri ktorej sa platne najprv pokryjú anti-PrP protilátkou, ktorá zachytáva špecifický PrP zo vzorky, ktorý je nakoniec detegovaný použitím sekundárnej anti-PrP protilátky. Obe formy ELISA sa môžu použiť so značenými (rádioaktívne, fluorescenčne, biotínom atď.) anti-Prp protilátkami, aby sa ešte zvýšila citlivosť detekcie.

MPK / Značky

MPK: G01N 33/68, G01N 33/00

Značky: diagnostiky, markera, tohto, ochorenia, spôsobu, testovanie, vykonávanie, detekcie, konformačného, diagnostický, spôsob, zariadenie

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/31-287768-sposob-diagnostiky-alebo-detekcie-konformacneho-ochorenia-testovanie-markera-konformacneho-ochorenia-diagnosticky-kit-a-zariadenie-na-vykonavanie-tohto-sposobu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob diagnostiky alebo detekcie konformačného ochorenia, testovanie markera konformačného ochorenia, diagnostický kit a zariadenie na vykonávanie tohto spôsobu</a>

Podobne patenty