Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaná rekombinantná DNA, autonómne replikovateľná v bunkách baktérií typu Corynebacterium, obsahujúca DNA sekvenciu kódujúcu aspartátkinázu, v ktorej je inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom desenzibilizovaná, a DNA sekvenciu pre diaminopimelát dekarboxylázu a DNA sekvenciu kódujúcu fosfoenolpyruvát karboxylázu. Tiež je opísaná baktéria typu Corynebacterium obsahujúca túto sekvenciu a spôsob prípravy L-lyzínu.

Text

Pozerať všetko

vynález sa týka spôsobu produkcie L-lyzínu kultiváciou mikroorganizmu, ktorý sa získal modifikáciou baktérie typu Corynebacterium, použitej na fermentačnú produkciu aminokyselín a podobne pomocou metódy, zakladajúcej sa na genetickom inžinierstve.L-lyzin, ktorý sa používa ako prísada do suchého krmiva, sa zvyčajne pripravuje fermentačnou metódou s použitím mutovaného kmeňa, produkujúceho L-lyzín patriaceho k baktériám typu Cotynebaclerium. Rôznymi L-lyzín produkujúcimi baktériami, ktoré sú V súčasnosti známe, sú tie,ktoré sa vytvorili umelou mutáciou, vychádzajúc zo štandardných kmeňov, patriacich k baktériám typu Corynebacterium.Čo sa týka baktérií typu Corynebacterium, je opísaný vektorový plazmid, ktorý je autonómne replikovateľný v bakteriálnych bunkách a má markerový gén pre odolnost proti liečivám (pozri US patent č. 4 514 502), a spôsob zavedenia génu do bakteriálnych buniek (napriklad zverejnená japonská patentová prihláška č. 2-207791). Tiež je opisaná možnost množenia L-treonín alebo L-izoleucín produkujúcich baktérií s použitím opísaných metód (pozri US patenty č. 4 452 890 a 4 442 20 s). Čo sa týka množenia L-lyzin produkujúcich baktérií, je známa metóda, pri ktorej gén, ktorý sa zúčastňuje biosyntézy L-lyzínu, je včlenený do vektorového plazmidu, aby amplifikoval gén V bakteriálnych bunkách (napríklad zverejnená japonská patentová prihláška č. 56-160997).Známe gény pre bíosyntézu L-lyzínu zahmujú napríklad gén pre dihydrodipikolinátreduktázu (zverejnená japonská patentová prihláška č. 7-75578) a gén pre diaminopimelátdehydrogenázu (Ishino S. a spol., Nucleic Acids Res. l§, 3917, 1987), V ktorýchje gén, zúčastňujúci sa biosyntézy L-lyzínu, klonovaný, ako aj gén pre fosfoenolpyruvátkarboxylázu (zverejnená japonská patentová prihláška č. 60-87788), gén pre dihydrodipikolínátsyntázu (japonský patentový spis č. 6-55149) a gén pre diaminopimelátdekarboxylázu (zverejnená japonská patentová prihláška č. 60-62994), v ktorých ampliñkácia génu ovplyvňuje produkciu L-lyzinu, Čo sa týka enzýmov, zúčastňujúcich sa biosyntézy L-lyzínu, je známy prípad enzýmu, ktorý podlieha inhibícii spätnou vazbou, ked sa použije ako štandardný typ. V tomto prípade sa produkcia L-lyzínu zlepší zavedením enzýmového génu, ktorý má takú mutáciu, že inhibícia spätnou väzbou sa desenzibilizuje. Známe gény tohto druhu špecificky zahmujú napríklad gén pre aspartátkinázu (Medzinárodný zverejnený spis WO 94/25605).Ako sme opisali, isté úspešne výsledky sa získali pomocou ampliñkovania génov pre systém na bíosyntézu L-lyzínu alebo zavedením mutovaných génov. Napriklad baktéria typu Corynebacterium, ktorá obsahuje mutovaný gén pre aspanátkinázu s desenzibilízovanou súčasnou inhibíciou lyzínom a treoninom, produkuje značné množstvo L-lyzínu (asi 25 g/l). Ale táto baktéria podlieha zníženiu rýchlosti rastu v porovnaní s baktériou, ktorá nemá žiadny mutovaný gén pre aspartátkinázu. Tiež sa uvádza, že produkcia L-lyzínu sa zlepší ďalším zavedením génu pre dihydrodipikolinátsyntázu popri mutovanom géne pre aspartátkinázu (Applied and Environmental Microbiology i(6), 1746 - 1752, 1991). Ale pri takejto baktérií dochádza k ďalšiemu zníženiu rýchlosti rastu.Taktiež sa neuvádza žiadny prípad, v ktorom by sa zamýšľalo zlepšiť rast zosilnením génu pre bíosyntézu L-lyzínu. Za súčasného stavu nie je známy žiadny prípad pre baktérie typu Corynebacterium, v ktorom by niekto bol úspešný v značnom zlepšení výťažku L-lyzínu bez obmedzenia rastu kombináciou viacerých génov pre bíosyntézu L-lyzínu.Cieľom tohto vynálezu je zlepšit výťažok L-lyzínu bez obmedzenia rastu baktérií typu Corynebacterium zosilnením viacerých génov pre bíosyntézu L-lyzínu v kombinácii v baktériách typu Cotynebacterium.Ked sa cieľová látka produkuje fennentačne s použitím mikroorganizmu, rýchlosť produkcie, ako aj výťažok cieľovej látky vzhľadom na zavedený materiál sú mimoriadne dôležitým faktorom. Cieľová látka sa môže produkovať pozoruhodné lacno zvýšením rýchlosti produkcie na jednotku fermentačného zariadenia. V súlade s tým je priemyselne mimoriadne dôležité, aby výťažok fermentácie a rýchlosť produkcie navzájom zodpovedali jeden druhému. Tento vynález navrhuje riešenie opísaného problému, aby sa fermentačne produkoval L-lyzín s použitím baktérií typu Corynebacterium.Princíp tohto vynálezu sa zakladá na skutočnosti, že rast baktérií typu Corynebacterium sa dá zlepšit a ich rýchlosť produkcie L-lyzínu sa dá zlepšit zosilnením kódu DNA sekvencie pre aspartátkinázu, v ktorej inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom je v podstate desenzibilizovaná, a kódovania DNA sekvencie pre diaminopimelátdekarboxylázu v porovnani s prípadom, v ktorom sú tieto DNA sekvencie zosilnené jednotlivo.Z prvého aspektu tohto vynálezu sa poskytuje rekombinantná DNA, autonómne replikovateľná V bunkách baktérií typu Corynebacterium, obsahujúca kód DNA sekvencie pre aspartátkinázu, v ktorej je inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom v podstate desenzibilizovaná, a kód DNA sekvencie pre diaminopimelátdekarboxylázu. Poskytuje sa tiež rekombinantná DNA, ktora ďalej obsahuje kód DNA sekvencie pre fosfoenolpyruvátkarboxylázu.Z druhého aspektu tohto vynálezu sa poskytuje baktéria typu Coiynebacterium, obsahujúca aspartátkinázu, v ktorej inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom je v podstate desenzibilizovaná, a obsahuje zosilnený kód DNA sekvencie pre diaminopimelátdekarboxylázu. Tiež sa poskytuje baktéria typu Carynebacterium, ktorá ďalej obsahuje zosilnený kód DNA sekvencie pre fosfoenolpyruvátkarboxylázu.Z tretieho aspektu tohto vynálezu sa poskytuje spôsob produkcie L-lyzinu, zahmujúci kroky kultiváeie ktorejkoľvek z baktérií typu Corynebacterium, ako je opísané skôr,vo vhodnom médiu, aby sa L-lyzín mohol kultivovať a hromadit v kultúre uvedenej baktérie, a odobrania L-lyzínu z tejto kultúry.V ďalšom sa na aspartátkinázu odkazuje ako na AK,na génový kód pre AK sa odkazuje ako na lysC, na AK,v ktorej je desenzíbilizovaná inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom, sa odkazuje ako na mutovanú AK, a na génový kód pre mutovanú AK sa odkazuje ako na mutovaný lysC, ak je to potrebné. Tiež na diaminopimelátdekarboxylázu sa odkazuje ako na DDC, na génový kód pre DDC sa odkazuje ako na lysA, na fosfoenolpyruvatkarboxylázu sa odkazuje ako na PEPC, a na génový kód pre PEPC sa odkazuje ako na ppď, ak je to potrebné.Baktérie typu Corynebacterium, na ktoré odkazujeme v tomto vynáleze, sú skupinou mikroorganizmov, ako sú definované V Bergeys Manual of Deterrninative Bacteriology,8. vydanie, str. 599, 1974, ktoré sú aeróbne, grampozitívne,acidolabilné tyčinky, ktoré nemajú žiadnu schopnost tvoriť spóry. Baktéríe typu Corynebacteríum zahmujú baktérie,patriace k rodu Carynebacterium, baktérie, patriace k rodu Brevíbacterium, ktorý sa doteraz zaraďoval do rodu Brevibacteríum, ale zjednotili sa ako baktérie, patriace v súčasnosti k rodu Corynebacterium, a baktérie, patriace k rodu Brevibacterium, úzko príbuzné s baktériami, patriacími k rodu Corynebacterium.Podľa tohto vynálezu sa vyprodukované množstvo a rýchlost produkcie L-lyzínu z baktérií typu Carynebacterium dá zlepšiť.1. Príprava génov pre biosyntézu L-lyzínu, použitých pre tento vynálezGény pre biosyntézu L-lyzínu, použité V tomto vynáleze, sa získajú prípravou chromozomálnej DNA z baktérie ako DNA donora, konštrukciou knižnice chromozomálnych DNA s použitím plazmidového vektora alebo podobne, výberom kmeňa, ktorý má požadovaný gén, a spätným získaním z vybraného kmeňa rekombinantnej DNA, do ktorej bol gén vložený. DNA donor pre gén pre biosyntézu L-lyzinu, použitý v tomto vynáleze, nie je špecificky obmedzený za predpokladu, že požadovaný gén pre biosyntézu L-lyzínu má expresiu enzýmového proteínu, ktorý pôsobí v bunkách baktérií typu Corynebacterium. Avšak DNA donorom je výhodne baktéria typu Corynebacterium.Všetky gény lysC, dapA a ppc, pochádzajúce z baktérií typu Corynebacterium, majú známe sekvencie. V súlade s tým sa dajú získat uskutočnením ampliñkácie metódou reakcie polymerázového reťazca (PCR pozri White T. J. a spol., Trends Genet. 5, 185, 1989).Každý z génov pre biosyntézu L-lyzínu, použitých v tomto vynáleze, sa dá získať určitými metódami, ako bude ukázané na príkladoch ďalej.DNA fragment, obsahujúci mutovaný lysC, sa dá pripraviť z mutovaného kmeňa, v ktorom je synergická inhibícia AK aktivity spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom v podstate desenzibilizovaná (Medzinárodný zverejnený spis W 0 94/25605).Takýto mutovaný kmeň sa dá získat napríklad zo skupiny buniek, pochádzajúcich zo štandardného kmeňa baktérií typu Corynebacterium, podrobeného mutačnému pôsobeníu použitím nomiálneho mutačného pôsobenia, ako je ultrafíalové ožiarenie a pôsobenie mutujúcim činidlom, ako je N-metyl-N-nitro-N-nitrozoguanidín (NTG). AK aktivita sa dá merať s použitím metódy, ktorú opísali Miyajima R. a spol. v The Joumal of Biochemistry § 3 (2), 139 - 148,1968. Najvýhodnejší takýto mutovaný kmeň je reprezentovaný L-lyzín produkujúcou baktériou AJ 3445 (FERM P-1944), odvodenou mutačným pôsobením od štandardného kmeňa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 (ktorá má súčasný zmenený názov Carynebacterium glutamicum).Altematívne sa mutovaný lysC dá získat tiež in vitro mutačným pôsobením na plazmid DNA, obsahujúci štandardný lysC. Z ďalšieho aspektu je známa informácia, týkajúca sa špecificky mutácie na desenzibilizáciu synergickej inhibície AK spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom(Medzinárodný zverejnený spis W 0 94/25605). V súlade s tým sa mutovaný lysC dá tiež pripraviť zo štandardného lysC na základe tejto informácie napríklad metódou na miesto zameranej mutagenézy.Fragment, obsahujúci lysC, sa dá izolovat z baktérií typu Corynebacterium prípravou chromozomálnej DNA napríklad metódou podľa autorov Saito a Miura (H. Saito a K. Miura, Biochem. Biophys. Acta 72, 619, 1963), a amplíñkáciou lysC metódou reakcie polyrnerázového reťazcaPríklady DNA primérov predstavujú jednovláknové DNA 23-méru a 21-méru, ktoré majú nukleotidové sekvencie, uvedené v SEQ 1 D č. l a 2 v zozname sekvencií, aby sa ampliñkovala napríklad oblasť asi 1643 bp kódu pre lysC na základe sekvencíe, známej pre Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Biology 5 (5), 1197 - 1204, 1991 Mol. Gen. Genet. 224, 317 - 324, 1990). DNA sa dá syntetizovat bežnou metódou s použitím zariadenia DNA synthesizer model 38 GB, vyrábaného firmou Applied Biosystems, a s použitím fosfoamidítovej metódy (pozri Tetrahedron Letters 22, 1859, 1981). PCR sa dá uskutočniť s použitím prístroja DNA Thermal Cycler Model PJ 2000, vyrábaného ñrmou Takara Shuzo, a s použitím Taq DNA polymerázy metódou, navrhnutou dodávateľom..le výhodné, ked sa lysC, amplifrkovaný PCR, naviaže na vektor DNA, autonómné replikovateľný v bunkách E. coli a/alebo baktérií typu Corynebacterium, aby sa prípravila rekombinantná DNA, a táto rekombinantná DNA sa vopred zavedie do buniek E. cali. Takýto postup uľahčuje nasledujúce operácie. Vektorom, autonómne replikovateľnýrn v bunkách E. colí, je výhodne plazmidový vektor, ktorý je výhodne autonónme replikovateľný v bunkách hostiteľa, vrátane napríklad pUC 19, pUCl 8, pBR 322,pHSG 299, pHSG 399, pHSG 398 a RSF 1010.Ked sa fragment DNA, ktorý má schopnost nechať plazmid, aby bol autonómne replikovateľný V baktériách typu Corynebacterium, vloží do týchto vektorov, môžu sa použít ako takzvaný kyvadlový Vektor, autonómne replikovateľný aj v E. colí, aj v baktériách typu Corynebacterium.Takýto kyvadlový Vektor zahrnuje nasledujúce. Uvedené sú mikroorganizmy, ktoré majú každý z vektorov, a prístupové čísla v medzinárodných depozitných miestach(v zátvorkách). pHC 4 Escherichia coli AJ 12617 (FERM BP-3532) pAJ 655 Escherichia coli AJ 11882 (FERM BP-l 36) Corynebacterium glutamicum SR 8201 (ATCC 39135) pAJ 1844 Escherichia COÍÍ AJ 1883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamícum SR 8202 (ATCC 39136) pAJ 6 I l Escherichia coli AJ 1 1884 (FERM BP-138) pAJ 3 l 48 Corynebacterium glutamícum SR 8203 (ATCC 39137) pAJ 440 Bacillus subtilis AJ 1 1901 (F ERM BP-140)Tieto vektory sa dajú získať z deponovaných mikroorganizmov nasledujúcim spôsobom. Bunky, odobraté vo fáze logaritmického rastu, sa lýzovali s použitím lyzozýmu a SDS, po čom nasledovalo oddelenie z lyzátu centrifúgovaním pri 30000 x g, aby sa získal supematant. K tomuto supematantu sa pridá polyetylénglykol, po čom nasleduje frakcionácia a čistenie pomocou centrifugácie s rovnovážnym gradientom hustoty chloridu cézneho-etídiumbromidu.E. cali sa dá transformovať zavedením plazmidu napríklad metódou D. M. Morrisona (Methods in Enzymology Q, 326, 1979) alebo metódou, pri ktorej sa na prijímajúce bunky pôsobí chloridom vápenatým, aby sa zvýšila priepustnost pre DNA (Mandel, M. a Higa, A., J. Mol. Biol. Q, 159, 1970).Štandardný lysC sa získa, ked sa lysC izoluje zo štandardného AK kmeňa, zatial čo mutovaný lysC sa získa,ked sa lysC izoluje z AK mutovaného kmeňa opísanou metódou.Príklad nukleotidovej sekvencie DNA fragmentu, obsahujúceho štandardný lysC, je uvedený v SEQ ID č. 3 V zozname sekvencíí. Aminokyselínová sekvencia oz-podjednotky štandardného AK proteínu je vyvodená z nukleotidovej sekvencie a je uvedená v SEQ ID č. 4 v zozname sekvencií spolu s DNA sekvenciou. V SEQ ID č. 5 je uvedená len aminokyselinova sekvencia. Aminokyselinová sekvencia B-podjednotky štandardného AI( proteínu je vyvodená z nukleotidovej sekvencie DNA a je uvedená v SEQ ID č. 6 v zozname sekvencií spolu s DNA sekvenciou. V SEQ ID č. 7 je uvedená len aminokyselinová sekvencia. V každej z týchto podjednotiek sa GTG použil ako iniciačný kodón a príslušná aminokyselina je reprezentovaná metioninom. Ale táto reprezentácia sa týka metionínu, valinu alebo formylmetionínu.Mutovaný lysC, použitý v tomto vynáleze, nie je špeciñcky obmedzený za predpokladu, že kóduje AK, v ktorej je Synergická inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom desenzibílizovaná. Ako príklad mutovaného lysC však uvádzame taký, ktorý má mutáciu, pri ktorej sa aminokyselinový zvyšok, zodpovedajúci 279-ému alanínovému zvyšku, keď sa počíta od N-konca, zamení za aminokyselinový zvyšok iný než alanín a iný, než je kyslá aminokyselina v oz-podjednotke, a aminokyselinový zvyšok, zodpovedajúci 30-ému alanínovému zvyšku od N-konca, sa zamení za aminokyselinový zvyšok iný než alanín a iný, než je kyslá aminokyselina v B-podjednotke v sekvencii aminokyselín AK štandardného typu. Aminokyselinová sekvencia AK štandardného typu špecificky zahmuje aminokyselinovú sekvencíu, uvedenú v SEQ ID č. 5 v zozname sekvencii ako oL-podjednotku a aminokyselinovú sekvencíu, uvedenú v SEQ ID č. 7 v zozname sekvencií ako B-podjednotku.Aminokyselinove zvyšky, výhodné ako zvyšky iné než alanín a iné než kyslá aminokyselina, zahmujú treonínové,argininové, cysteinové, fenylalanínové, prolínové, serínovć,tyrozínovć a valínove zvyšky.Kodón, zodpovedajúci aminokyselinovému zvyšku,ktorý sa má nahradiť, nie je špecificky obmedzený, čo sa týka jeho typu, za predpokladu, že kóduje aminokyselinový zvyšok.Predpovedá sa, že aminokyselinová sekvencia AK štandardného typu sa môže mieme odlišovať v závislosti od rozdielov v bakteriálnych druhoch a bakteriálnych kmeňoch. Tie AK, ktoré majú mutáciu na základe napríklad nahradenia, odstránenia alebo vloženia jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov v jednej alebo viacerých polohách, nevýznamných pre enzýmovú aktivitu, ako je opísané skôr, sa môžu tiež použiť pre tento vynález. DNA kód pre AK so spontánnou mutáciou sa dá získať izoláciou DNA, ktorá je krížiteľná napríklad s DNA s časťou nukleotidovej sekvencie, uvedenej vSEQ ID č. 3 za prísnych podmienok. Pod prísnyrnj podmienkami, na ktoré odkazujeme, máme na mysli podmienky, pri ktorých sa vytvára špecifický hybrid a nevytvára sa nešpecifický hybrid. Je ťažké jasne vyjadriť tieto podmienky číselnými hodnotami. Ale príkladom takýchto podmienok sú podmienky, pri ktorých nukleové kyseliny s vysokou homológíou, napríklad DNA s homológiou nie menšou než 90 , sa krížia navzájom a nukleové kyseliny s homológiou nižšou, než je uvedená, sa navzájom nekrížia, alebo podmienka teploty od teploty vytopenia (Tm) úplne Zostaveného hybridu po (Tm- 30) °C, výhodne od Tm po (Tm - 20 ) °C a koncentrácia soli zodpovedajúca l x SSC, výhodne 0,1 x SSC.Iné AK, ktoré majú umelú mutáciu na základe napriklad nahradenia, odstránenia alebo vloženia iného jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov, sa tiež môžu použit za predpokladu, že nevyvíjajú žiadny vplyv na AKaktivitu ana desenzibilizáciu synergickej inhibície spätnou Väzbou L-lyzínom a L-treonínom. DNA kód pre AK s umelou mutáciou sa dá získat modifikáciou nukleotidovej sekvencie, aby došlo k nahradeniu, odstráneniu alebo vloženiu na špecifickom mieste napríklad miestne špecitickou mutagenézou. Tiež lysC s mutáciou sa dá ziskat pôsobením známym mutagénom. Pôsobenie mutagćnom zahmuje in vitro pôsobenie na DNA, obsahujúcu lysC, hydroxylamínom alebo podobne a pôsobenie na mikroorganizmus, ktorý má DNA, obsahujúcu lysC, mutagénom, ako je ultraíialove žiarenie alebo mutagénne činidlo, ktoré sa používa na bežnú umelú mutagenézu, ako je N-metyl-N-nitro-N-nítrozoguanidín (NTG) alebo kyselina dusičná. Po pôsobení mutagénom sa miesto, na ktoré sa zaviedla mutácia, alebo na ktorom došlo k mutácii, dá stanoviť výberom DNA alebo mikroorganizmu, ktorá kóduje alebo ktorý produkuje AK, ktorá má AK aktivitu, a ktorej aminokyselinová sekvencia je mutovaná z DNA, podrobenej pôsobeniu mutagénom alebo z mikroorganizmu, podrobeného pôsobeniu mutagénom. Miesto zavedenej mutácie nie je špecificky obmedzené za predpokladu, že sa v podstate nevyvíja žiadny vplyv na AK aktivitu a na desenzibilizáciu inhibície spätnou väzbou. Počet zavedených mutácií sa mení V závislosti od miesta a druhu mutovanej aminokyseliny v priestorovej štruktúre proteínu a nie je špecificky obmedzený za predpokladu, že sa v podstate nevyvíja žiadny vplyv na AK aktivitu a na desenzibilizáciu inhibície spätnou väzbou. Tento počet je obyčajne 1 až 20, výhodne 1 až 10.Kmeň AJ 12691, získaný zavedením mutovaného lysC plazmidu p 399 AK 9 B do kmeňa AJ 12036 (F ERM BP-734),ako štandardného kmeňa Brevibacteríum lactofrarmentum bol deponovaný 10. apríla 1992 pod prístupovým číslom FERM P-12918 v National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology of Ministry of Intemational Trade and Industry(1-3, Higashi l-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305 Japonsko), prenesený do medzinárodného depozitu na základe Budapeštianskej dohody z 10. februára 1995 a deponovaný pod prístupovým číslom FERM BP-4999.DNA fragment, obsahujúci lysA, sa dá pripraviť z chromozómu baktérie typu Corynebacterium pomocou PCR. DNA donor nie je špecificky obmedzený, avšak jeho príklad predstavuje kmeň Brevibacterium Iactafermenrum ATCC 13869.V baktéríách typu Corynebacterium lysA tvorí operón spolu s argS (gén pre arginyl-tRNA syntézu) a lysA existuje za argS. Expresia lysA sa reguluje promótorom, existujúcim pred argS (pozri Journal of Bacteriology, Nov.,7356 - 7362, 1993). DNA sekvencie týchto génov sú známe pre Corynebacterium glutamicum (pozri Molecular Microbiology 5 (11), 1819 - 1830, 1990 Molecular and General Genetics 212, 112 - 119, 1988), na základe čoho sa dajú pripraviť DNA priméry pre PCR. Špeciíickými príkladmi takýchto DNA primérov sú DNA z 23-mérov, ktoré majú nukleotidové sekvencie uvedené v SEQ ID č. 8 v zozname sekvencií (zodpovedajúce číslam nukleotidov 11 až 33 v sekvencíi nukleotidov, opísanej v Molecular Microbiology i (11), 1819 - 1830, 1990) a SEQ ID č. 9 (zodpovedajúce číslam nukleotidov 1370 až 1392 v sekvencii nukleotidov,opisanej V Molecular and General Genetics 2412, 112 - 119,1988). Syntéza DNA, PCR a príprava plazmidu, obsahujúceho získanú lysA, sa dá uskutočniť tým istým spôsobom,ako bolo opisané pre lysC.V príklade, ktorý bude opísaný neskôr, sa použil DNA fragment, obsahujúci promótor, argS a 1 ysA, aby sa zosilnillysA. Ale argS nie je pre tento vynález podstatný. Je možné použít DNA fragment, V ktorom je lysA naviazaný tesne za promótorom.Príklady sekvencie nukleotidov DNA fragmentu, obsahujúceho argS a lysA, a vyvodenej sekvencie aminokyselín, ktorá sa má zakódovať touto sekvenciou nukleotidov,sú uvedené v SEQ ID č. 10. Príklad sekvencie aminokyselín, zakódovanej argS, je uvedený v SEQ ID č. 11 a príklad sekvencie aminokyselín, zakódovanej lysA, je uvedený v SEQ 1 D č. 12. Okrem DNA fragmentov, kódujúcich tieto sekvencie aminokyselín môže tento vynález ekvivalentne použiť DNA fragmenty, kódujúce sekvencie aminokyselín v podstate tie isté, ako sú sekvencie aminokyselín, uvedené v SEQ 1 D č. 12, a síce sekvencie aminokyselín s mutáciou na základe napríklad nahradenia, odstránenia alebo vloženia jednej alebo viacerých aminokyselín za predpokladu, že nemajú žiadny podstatný vplyv na DDC aktivitu. lysA so spontánnou alebo umelou mutáciou sa dá získať tým istým spôsobom ako pre DNA kód pre AK s mutáciou, ktora nevyvíja žiadny vplyv na A 1( aktivitu a na desenzibilizáciu synergickej ínhibície spätnou väzbou L-Iyzínom a L-treonínom.DNA fragment, obsahujúci ppc, sa dá pripraviť z chromozómu baktérie typu Carjynebacterium pomocou PCR. DNA donor nie je špecificky obmedzený a jeho príkladom je kmeň Brevíbacterium lactafermentum ATCC 13869.DNA sekvencie ppc génu sú zname pre Carynebacterium glutamicum (pozri ORegan M. a spol., Gene Z 1, 237 - 251, 1989), na základe čoho možno pripraviť DNA prímery pre PCR, Špecifické príklady takýchto DNA primérov predstavujú DNA z 23-mérov s nukleotidovými sekvenciami, uvedenými v SEQ 1 D č. 13 a 14 v zozname sekvencií. Syntéza DNA, PCR a príprava plazmidu, obsahujúceho získaný ppc, sa dá uskutočniť tým istým spôsobom, ako bolo opísané pre lysC.Sekvencia nukleotidov DNA fragmentu, obsahujúceho ppc, a vyvodená sekvencia aminokyselín, ktora sa má zakódovat touto sekvenciou nukleotidov, sú uvedené v SEQ ID č. l 5. V SEQ 1 D č. 16 je uvedená len sekvencia aminokyselín.Okrem DNA ñagmentov, kódujúcich tieto sekvencie aminokyselín, tento vynález môže ekvivalentne použiť DNA fragmenty, kódujúce sekvencie aminokyselín v podstate tie isté, ako je sekvencia aminokyselín, uvedená v SEQ 1 D č. 16, a síce sekvencie aminokyselín s mutácíou na základe napríklad nahradenia, odstránenia alebo vloženia jednej alebo viacerých aminokyselín za predpokladu, že nemajú žiadny podstatný vplyv na PEPC aktivitu. ppc so spontánnou alebo umelou mutáciou sa dá získat tým istým spôsobom ako pre DNA kód pre AK s mutáciou, ktorá nevyvíja žiadny vplyv na AK aktivitu ana desenzibilizáciu synergickej inhibície spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom.ppc z baktérií typu Corynebacterium tvori operón spolu s gap (gén pre glyceraldehyd-S-fosfátdehydrogenázuy pgk(gén pre fosfoglycerátkinázu) a tpi (gén pre triózofosfátízomerázu) a ppc existuje za tpi. Expresia ppc sa reguluje promótorom, existujúcim pred pgk (pozri Schwínde J. W. a spol., J. Bacteriol. 175 (12), 3905 - 3908, 1993). Preto, tak ako uvedený lysA, sa ppc dá ampliñkovat spolu s pgk a tpi pomocou PCR, aby sa použil DNA fřagment, obsahujúci pgk, tpi a ppc. Ako ukážeme v príklade, ktorý bude opísaný neskôr, je možne použit DNA fragment, v ktorom je vhodný promótor naviazaný tesne pred kódujúcou oblasťouPEPC. Promótor zahmuje promótor lysC, tac promótor, pochádzajúci z E. coIi, a trc promótor.2. Rekombinantná DNA a baktéría typu Carynebacterium podľa tohto vynálezuRekombinantná DNA obsahuje kódujúcu DNA sekvenciu pre aspartátkinázu, v ktorej je inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom v podstate desenzibilizovaná, a kódujúcu DNA sekvenciu pre diarninopímelátdekarboxylázu a je autonómne replikovateľná v bunkách baktérií typu Corynebactería. Vo výhodnom uskutočnení rekombinantná DNA ďalej popri uvedených DNA sekvenciách obsahuje kódujúcu DNA sekvenciu pre fosfoenolpyruvátkarboxylázu.Baktćria typu Corynebacterium podľa tohto vynálezu má aspanátkinazu (mutovanú AK), v ktorej je inhibícia spätnou väzbou L-lyzínom a L-treonínom v podstate desenzibilizovaná, pričom DNA kód (lysA) pre díaminopimelátdekarboxylázu je zosilnený. Vo výhodnom uskutočnení je baktériou typu Corynebacteríum podľa tohto vynálezu baktéria typu Carynebacteríum, v ktorej je DNA kód(ppc) pre fosfoenolpyruvátkarboxylázu ďalej zosilnený.Výraz zosilniť sa tu týka skutočnosti, že vnútrobunková aktivita enzýmu, zakódovaného touto DNA, sa zvýši napriklad zvýšením počtu kópií génu použitím silného promótora, použitím génového kódovania pre enzým s vysokou špecifickou aktivitou alebo kombináciou týchto prostriedkov.Baktériamí typu Corynebacteríum, ktoré majú mutovanú AK, môžu byt tie, ktore produkujú mutovanú aspartátkinázu ako výsledok mutácie, alebo tie, ktoré sú transformované zavedením mutovanej lysC.Príklady baktérií typu Corynebacterium, použitých na zavedenie uvedenej DNA, zahrnujú napríklad nasledujúce,lyzín produkujúce kmene štandardného typu Carynebacteríum acetoacidophilum ATCC 13870 Carynebacterium acetoglutamícum ATCC 15806 Corjynebacterium callunae ATCC 15991Corynebacterium glutamicum ATCC 13032(Brevíbacteriumjlavum) ATCC 14067 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Brevibacterium saccharolytícum ATCC 14066 Brevíbacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacteríum roseum ATCC 13825 Brevibacterium thíogenilalis ATCC 19240 Microbacterium ammoniaphílum ATCC 15354 Corynebacterium thermoaminogenes AJ 12340 (FERM BP-1539)Iné než opísané bakteriálne kmene, tie kmene, ktoré sa dajú použiť ako hostiteľ, zahmujú napríklad mutované kmene so schopnosťou produkovať L-lyzín, odvodené od uvedených kmeňov. Takéto umelo mutované kmene zahrnujú nasledujúce proti S-(2-aminoetyl)-cysteínu (v ďalšom skrátené na AEC) odolné mutované kmene (napriklad Brevíbacteríum lactofermentum AJ l 1082 (NRRL B-1147),japonské patentové spisy č. 56-1914, 56-1915, 57-14157,57-14158, 57-30474, 58-10075, 59-4993, 61-35840, 62-24074, 62-36673, 5-11958, 7-112437 a 7-112438) mutované kmene, ktoré vyžadujú amínokyselinu, ako je L-homoserín, na svoj rast (japonské patentové spisy č. 48-28078 a 56-6499) mutovane kmene, ktoré majú odolnost proti AEC a vyžadujú aminokyseliny, ako L-leucin, L-homoserín, L-prolín, L-serin, L-arginín, L-alanin a L-valín (US patenty č. 3 708 395 a 3 825 472) mutované kmene, pro

MPK / Značky

MPK: C12N 15/52, C12P 13/00, C12N 1/21

Značky: reprodukovaná, autonomně, koryneformnej, rekombinantná, koryneformná, bakterie, spôsob, výroby, buňkách, baktéria, l-lyzínu

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/31-285146-rekombinantna-dna-autonomne-reprodukovana-v-bunkach-koryneformnej-bakterie-koryneformna-bakteria-a-sposob-vyroby-l-lyzinu.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu</a>

Podobne patenty