Promótor k IL-18BP, jeho príprava a použitie

Číslo patentu: E 6935

Dátum: 09.10.2003

Autori: Hurgin Vladimir, Rubinstein Menachem, Novick Daniela

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

0001 vynález sa týka promótora proteínu viažuoeho interleukín-1 B (IL-18 BP), jeho prípravy a použitia. DOTERAJŠÍ STAV TECHNIKY0002 Proteíny viažuce cytokíny (rozpustné receptory cytokínov) sú obyčajne extracelulárnymi doménami viažucimi ligandy zodpovedajúcich receptorov cytokínov na povrchu bunky. vznikajú bud alternatívnym splicingom alebo proteolytickým štiepením receptora na povrchu bunky. Tieto rozpustné receptory boli už opisané v minulosti napríklad rozpustné receptory pre IL-6 a IFNy (Novick a spol. 1989), TNF (Engelmann a spol. 1989 a Engelmann a spol. 1990), IL-1 a IL-4 (Maliszewski a spol. 1990) a IFNot/B (Novick a spol. 1994,Novick a spol. 1992). Zdá sa, že jeden z proteínov viažucich cytokíny, nazývaný osteoprotegerln (OPG, známy aj ako inhibičný faktor osteoklastov - OClF), člen skupiny TNFR/Fas, je prvým príkladom rozpustného receptora, ktorý existuje iba vo forme sekretovaného proteínu (Anderson a spol. 1997, Simonet a spol. 1997,Yasuda a spol. 1998).0003 Protein viažuci interleukin-18 (IL-18 BP) bol afinitne vyčistený z moču na kolóne lL-18 (Novick a spol. 1999). lL-18 BP ruší indukciu lFNy prostrednictvom lL-18 aaktiváciu NFkB prostrednictvom lL-18 in vitro. Okrem toho lL-18 BP potláča indukciu lFNy ułnyšl, ktorým sa predtým naočkoval LPS. Gén IL-18 BP bol Iokalizovaný na ľudskom chromozóme 11 a pre transmembránovú doménu sa vgenómovej sekvencii 8,3 kb zahŕňajúcej gén IL-18 BP nenašlo nijaké kódovanie exónov. U ľudí boli doteraz zistené štyri izoformy lL-18 BP vygenerované alternatívnym mRNA splicingom. Boli označené ako IL-18 BP a, b, c a d, pričom všetky majú rovnaký N-terminálny koniec a líšia sa v C-terminálnom konci (Novick aspoi. 1999). Tieto izoformy sa líšia medzi sebou svojou schopnosťou viazat lL-18 (Kim aspoi. 2000). Spomedzi týchto štyroch izoforiem je známe, že ľudská izoforma iL-18 BP (hIL-18 BP) a a c majú schopnost neutraiizovat IL-18. Najrozšírenejšia izoforma iL-18 BP, zcstrihaný variant izoformy a, vykazuje vysokú añnitu pre IL-18 s rýchlym on-rate a pomalým off-rate a s disociačnou konštantou (Kd) približne 0,4 nM (Kim a spol. 2000). lL-18 BP je konštitutívne exprimovaný v slezine (Novick 1999) a cirkuluje v plazme v koncentráciách 2,5 ng/ml (Novick a spol. 2001). Zvyšky hrajúce úlohu v interakcii IL-18 s IL-18 BP boli opísané prostrednictvom počítačového modelovania (Kim a spol. 2000) a založené na interakcii medzi podobným proteinom IL-1 B s IL-1 R typ l (Vigers a spol. 1997). Podla modelu väzby lL-18 na iL-18 BP bolo navrhnuté, že zvyšok Glu v pozícii 42 a zvyšok Lys v pozícii 89 v lL-18 sa naviažu na Lys-130 a Glu-114 v |L-18 BP (Kim a spol. 2000).0004 Ako bolo spomenuté vyššie, IL-18 indukuje lFNy, oktorom bolo nedávno zistené, že indukuje vygenerovanie IL-18 BPa mRNA in vitro (Muhl a spol. 2000). Preto lL-1 BBPa by mohol slúžit ako vypinací shut off signál, ktorý ukončí zápalovú reakciu.0005 lL-18 BP je výrazne homologický so skupinou proteínov kódovaných niekoľkými poxvírusmi (Novick a spol. 1999, Xiang a Moss 1999). Inhibicia IL-18 týmto predpokladaným vírusovým iL-18 BP môže oslabit zápalovú antivirusovú Th 1 odpoveď.Sérový iL-18 BP je výrazne zvýšený v sepse, čo poukazuje na jeho úlohu v regulovaní imunitných reakcii in vivo (Novick a spol. 2001). Skutočne, iL-18 BP je indukovaný prostredníctvom IFNy vrôznych bunkách, čo naznačuje, že slúži ako inhibítor negatívnej spätnej väzby imunitnej odpovede sprostredkovanej IL-18 (Mughl a spol. 2000).0006 Predbežné výsledky naznačujú, že IL-1 BBP mRNA je možné zistiť v leukocytoch, v bunkách hrubého čreva, tenkého čreva, prostaty aosobitne v bunkách sleziny (Novick aspoi. 1999). Komponentné bunky sleziny pozostávajú z makrofágov, lymfocytov a z plazmatických buniek s ďalšími bunkami pochádzajúcimi z krvného obehu.0007 Aktivita elementov, ktoré kontrolujú transkripciu, promótor a enhancery, sa medzi jednotlivými typmi buniek výrazne llšia. Promótory a enhancery pozostávajú zkrátkych sledov DNA sekvencil, ktoré špeciñclq/ interagujú s bunkovými proteínmi hrajúcimi úlohu vtranskripcii (prehľadná publikácia autorov Dynan a Tjian 1985, McKnight a Tjian 1986, Sassone-Corsi a Borreli 1986, a Maniatis a spol. 1987). Kombinácia rôznych rozpoznávacích sekvencil a množstva obdobných transkripćných faktorov determinuje účinnost, s ktorou je daný gén v danom type buniek transkribovaný. Mnohé eukaryontné promótory obsahujú dva typy rozpoznávacích sekvencii TATA box a upstream promótorové elementy. Predpokladá sa, že TATA box,lokalizovaný 25-30 bp upstream od iniciačného miesta transkripcie, hrá úlohu v riadení RNA polymerázy lI na začatie RNA syntézy na správnom mieste. Na rozdiel od neho upstream promótorové elementy determinujú rýchlosť, ktorou sa transkripcia začína. Zosilňovacie elementy môžu stimulovať transkripciu až 1000-násobne z naviazaných homologických alebo heterológnych promótorov. Avšak na rozdiel od upstream promotorových elementov enhancery sú aktívne, ak sú umiestnené downstream od miesta začatia transkripcie alebo vo velkej vzdialenosti od promótora. Mnohé enhancery bunkových génov fungujú výlučne len v osobítnom type tkaniva alebo buniek (prehľadná publikácia autorov Voss a spol. 1986, Maniatis a spol. 1987). Okrem toho niektoré enhancery sa stávajú aktivnymi iba v určitých podmienkach, ktoré sa vygenerujú v prítomnosti induktora, ako je napríklad hormón alebo ión kovu (prehľadná publikácia autorov SassoneCorsi a Borrelli 1986, a Maniatis 1987). Kvôli týmto rozdielom v špecitičností buniek bunkových enhancerov výber promotora a zosilňovacích elementov, ktoré sa majú ínkorporovať do eukaryontného expresneho vektora, bude determinovaný typmi.z, buniek, vktorých sa rekombinantný gen má exprimovatí Naopak, použitie dopredu pripraveneho vektora obsahujúcého špecifický promótor a bunkový enhancer môže závažným spôsobom Iimitovat typy buniek,v ktorých možno dosiahnut expresiu.0008 Mnohé zosilňovacie elementy odvodené z vírusov majú širší hostiteIský rozsah a sú aktívne v rôznych typoch tkanív, hoci sa pozorujú výrazne kvantitatlvne rozdiely medzi jednotlivými typmi buniek. Napríklad skorý enhancer SV 40 je promiskuitne aktívny v mnohých typoch buniek odvodených z rôznych druhov cicavcov, a preto sa použili vektory inkorporujúce tento enhancer (Dijkema a spol. 1985). Dve iné kombinácie enhancera/promótora, ktoré sú aktívne v roznych typoch buniek, sú odvodené z dlhej opakujúcej sa oblasti(LTR) genómu vírusu Rousovho sarkómu (Gorman a spol. 1982 b) az ľudského cytomegalovírusu (Boshart a spol. 1985).0009 vynález sa týka DNA sekvencie kódujúcej ľudský lL-18 BP promótor (SEQ ID N 021), alebo fragment,napríklad fragment v SEQ lD NO. 2 alebo 3, alebo ich funkčný derivát, kde 3 koniec uvedenej DNA sekvencie alebo je fragmentu zahŕňa SEQ ID NO 5.0010 peciñckejšie, derivát podľa vynálezu môže byt DNA podľa vynálezu zmutovaná na jednom alebo viacerých AP 1 miestach prítomných v silencer elemente prítomnom v sekvencii, a DNA sekvencia môže ďalej obsahovat gén operatívne naviazaný na lL-18 BP promótor.0011 Vjednom aspekte vynálezu gén môže kódovat napríklad lL-18 BP alebo heterológny protein, ako je napríklad luciferáza, interferón beta, TNF, erytropoetín, tkanivový plazminogénový aktívátor, stimulačný faktor kolónií granulocytov, superoxiddismutáza s mangánom, imunoglobulín alebo jeho fragment, rastový hormón,FSH, hCG, IL-18, hsLDLR a proteíny viažuce TNF receptor.0012 vynález poskytuje vektor obsahujúci DNA sekvenciu kódujúcu ľudský lL-18 BP promótor, hostiteIskú bunku obsahujúcu tento Vektor, napríklad CHO, WlSH. HepG 2, Cos, CV-1, HeLa a Hakat U 937 bunky a spôsob produkcie rekombinantného proteínu zahŕňajúci kultiváciu hostiteľskej bunky a izoláciu vyprodukovaného rekombinantného proteínu.0013 Okrem toho vynález poskytuje rekombinantný vírusový Vektor, ktorý zahŕňa ćast vírusového genómu,DNA fragment kódujúcu daný gén, aDNA fragment zahŕňajúci DNA sekvenciu kódujúcu ľudský lL-18 BP promótor. Špeciñckejšie, vírusový protein môže byt napríklad adeno asociovaný vírus a retrovlrus, napríklad HIV, HFV, MLV, FIV a VSV.0014 vynález poskytuje aj spôsob regulácie bunkovo špeciñckej expresie daného génu, zahŕňajúci transdukciu cieľovej cicavčej bunky virusovým vektorom podľa vynálezu v cieľovej bunke, napriklad v hemopoetickej kmeňovej bunke a v monocyte. Daný gén môže byt napríklad proteínom nesúcim rezistenciu voči HIV infekcii. Regulácia bunkovo špeciñckej expresie daného génu sa môže použit napríklad v liečbe HIV infekcie, v liečbe hemopoetických porúch ako je napríklad SClD, chronická granulomatózna choroba a talasémia.0015 Ďalej je opísaný spôsob génovej terapie na liečbu choroby u pacienta vykazujúceho zvýšený IFNy vtelesnom tkanive, zahŕňajúci podávanie účinného množstva vírusového vektora podľa vynálezu, voliteľne ďalej zahŕňajúci podávanie faktorov IL-6 a/alebo TNFU. a/alebo IRF a/alebo C/EBPB.0016 V ďalšom aspekte vynález sa týka transgénnych myší nesúcich sekvenciu DNA, kódujúcu sekvenciu DNA podľa vynálezu.0017 Okrem toho vynález vysvetľuje použitie sekvencie DNA kódujúcej ľudský IL~ 18 BP promótor (SEQ ID NO 1), alebo jeho fragment alebo funkčný derivát, kde 3 koniec uvedenej sekvencie DNA alebo jej fragmentu zahŕňa sekvenciu SEQ ID N 025 na výrobu lieku na liečenie choroby.0018 vynález poskytuje aj farmaceutický prostriedok zahŕňajúcu terapeuticky účinne množstvo sekvencie DNA kódujúcej ľudský lL-18 BP promótor (SEQ lD N 021), alebo jeho fragment alebo funkčný derivát, kde 3 koniec uvedenej sekvencie DNA alebo jej fragmentu zahŕňa SEQ lD NO 5.STRUČNÝ OPIS OBRÁZKOV 0019Obrázku 1 je schematické znázornenie oblasti promótora génu lL-18 BP včítane týchto 5 regulaćných elementov.Obrázok 2 ukazuje kinetiku indukcie lL-18 BP a Synergie s TNFa a lL-6 (A) lFNy indukuje lL-18 BP spôsobom závislým od dávky a času v ľudských bunkách WlSH. Bunky boli inkubované vo vyznačených koncentrácíách lFNy počas 24 a 48 h. (B) Synergická účinky TNFa, IL-6 a ich kombinácie na lL-18 BP indukovaný prostredníctvom lFNy. Bunky HepG 2 boli inkubované s rovnakými kombináciami IFNy (100 U/ml), TNFa (20 ng/ml) a lL-6 (300 U/ml). indukcia lL-18 BP v každej kombinácii bola výrazne vyššia (p 0,05), ako indukcia samotným IFNy. Údaje sú priemerné hodnoty i SD (n 3 pre A, n 4 pre B).Obrázok 3 ukazuje schematické znázornenie konzervovanej exón-intrón organizácie ľudského a myšacieho génu lL-18 BP. Ľudský gén IL-18 BPa sa porovnal s myšacím génom lL-18 BPd. Exóny sú-3 vyznačené. Miesto začatia transkripcie, miesto začatia translácie (ATG), stop kodón (Stop) a signál polyadenylácie (PAS) sú vyznačené pre ľudský gén IL-18 BPa.Obrázok 4 ukazuje, že indukcia IL-18 BP prostrednictvom lFNy je na úrovni transkripcie azávisi od de novo proteosyntézy. (A) Semikvantitativna RT-PCR v lL-18 BP mRNA z buniek HepG 2 buniek, ktoré boli predtým inkubované s aktinomycinom D (1 g/ml, 30 min), premyté a inkubované s lFNy (100 U/ml) počas vyznačených časových intervalov. RT-PCR zmRNA B aktinu je ukázaná ako kontrolná (B) semikvantitatívna RT-PCR v lL-18 BP mRNA z buniek HepG 2, ktoré boli predtým inkubované s cykloheximidom (20 g/ml) a s lFNy (100 U/ml) počas vyznačených časových intervalov.Obrázok 5 ukazuje bazálnu aktivitu a aktivitu indukovanú prostredníctvom IFNy v luciferázových reporterových vektoroch nesúcich ľudský lL-18 BP promótor. Veľkost inzertu rozprestierajúceho sa od miesta začatia transkripcie (1) je uvedená v zátvorkách. Zakrúžkované čísla znamenajú rôzne elementy odpovede 1. GAS, 2. IRF-E, 3. C/EBP-E (2 miesta). 4. Silencer (spomaľovač). 5. Distálny enhancer(zosilňovač). Plné štvorce znamenajú mutáciu v špecifickom elemente odpovede. HepG 2 bunky kotranfekované s vyznačeným reporterovým vektorom a s pSV 40 BGAL. Všetky hodnoty luciferázy boli normalizované podľa aktivity B-galaktozidázy. (A) Aktivita Iuoiferázy v extraktoch neindukovaných buniek vo vzľàhu kaktivite buniek transfekovaných vektorom pGL 3-Basic. (B) Aktivita Iuciferázy v bunkách transfekovaných vybranými vektormi a indukovaných s lFNy. Násobná indukcia je vyššie ako bazálna aktivita podľa údajov v (A).Obrázok 6 ukazuje, že IRF-1 je dôležitý pre expresiu lL-18 BP u myši. Serový lL-18 BP myši C 57 Bl/6 IRF-1 a kontrolných myši C 57 Bl/6, ktoré dostali intraperitoneálnu injekciu myšacieho lFNy (53 000 u/myš). Myšiam sa odobrala krv pred injekciou a 24 h po podaní injekcie. Sérový lL-18 BP bol stanovený spôsobom ELISA Údaje sú priemerné hodnoty i SE (n 6 v každej skupine). Rozdiely medzi sérovým lL-18 BP v kontrolných a lRF-deficitných myšiach, ako aj indukcia lL-18 BP v kontrolných myšiach boli štatisticky významné (p 0,05).Obrázok 7 ukazuje úlohu IRF-1 a C/EBPB v indukcii génu lL-18 BP a ich vzťah. (A) Test posunu elektroforetickej mobility (EMSA Príklad 18) dsDNA sond zodpovedajúcich bázam -33 až -75 (lRF-E, ľavý panel) a -8 až -55 (GAS, pravý panel). HepG 2 bunky sa ovplyvnili s lFNy počas vyznačených časových intervalov ajadrové extrakty sa nechali reagovat so sondami IRF-E alebo GAS. Posunuté prúžky sú vyznačené plnými šípkami. Superposunutý prúžok je označený prázdnou šípkou. (B) Semikvantitativna RT-PCR u lL-18 BP mRNA z buniek HepG 2, ktoré boli transfekované s vyznačenými kombináciami expresných vektorov IRF-1 alebo C/EBPB. Tam, kde je uvedené, sa pridal IFNy a o 5 h neskôr sa bunky izolovali. Hodnoty sa norrnalizovali podľa mRNA 3 aktinu. (C) Aktivita luciferázy v bunkách transfekovaných luciferazovým reporterovým vektorom pGL 3 (1272) obsahujúcim kompletný lL-18 BP promótor, spolu svyznačenou koncentráciou pCDNA 3-IRF-1 (kolieska) a 1 g/106 buniek s pCDNA 3 C/EBPB. V alternativnom spôsobe sa bunky transfekovali s označenou koncentráciou pCDNAS-C/EBPB(štvorce) a s 0,1 g/105 buniek s pCDNAS-IRF-1. Aktivita Iuclferázy bola normalizovaná podľa aktivity B Gal. (D) Imunobloty jadrových acytoplazmatických extraktov (pozri Príklad 17 o príprave extraktov) z buniek ovplyvnených s IFNy (100 U/ml, 2 h). Extrakty sa imunoprecipitovali (IP) a boli imunoblotovane(IB) s vyznačenými protilátkami, Obrázok 8 ukazuje faktory viažuce sa na promótor lL-18 BP po indukcii s lFNy. (A) EMSA s proximálnym C/EBPB E a extrakty celých buniek po ovplyvnenl s ĺFNy. Tam, kde je vyznačené, extrakty boli superposunuté s vyznačenými protilátkarni. (B) EMSA so sondou zodpovedajúcou distálnemu enhanceru a extrakty celých buniek po ovplyvnenl s IFNy. Tam, kde je vyznačené, extrakty boli superposunuté s vyznačenými protilátkami s alebo bez kompetície s dsDNA zodpovedajúcou proximálnej polovici sondy. Posunuté prúžky sú vyznačené plnými šípkami a superposunutý prúžok je vyznačený prázdnymi šípkami.0020 vynález sa týka promótora ľudského IL-18 BP. Tento promótor riadi konštitutivnu expresiu lL-18 BP vjednotlivých typoch buniek, napriklad v monocytoch, a indukciu expresie lL-18 BP sprostredkovanú s IFNy v mnohých typoch buniek. Promótor ľudského IL-18 BP je schopný riadiť konštitutivnu a lFNy-indukovanú expresiu heterológneho proteínu.0021 vynález sa týka sekvencie DNA kódujúcej ľudský lL-18 BP promótor (SEQ lD N 011), alebo jeho fragment alebo funkčný derivát, kde 3 koniec uvedenej sekvencie DNA alebo jej fragmentu zahŕňa SEQ ID NO 5. lL-18 BP mRNA sa nachádza vleukocytoch, v bunkách hrubého a tenkého čreva, prostaty. a hlavne v bunkách sleziny (Novick a spol, 1999). Vjednom z príkladov uvedených nižšie bolo dokázané, že proteín IL-18 je konštitutivne exprimovaný v monocytoch.Bolo zistené, že expresia lL-18 BP je indukovaná interferónom lFNy, ato nielen vmonocytoch, ale aj v mnohých rôznych typoch buniek, a že táto indukcia sa môže ďalej zosilnit pridaním lL-6 a TNFa.0022 Bolo zistené, že de novo proteosyntéza má zásadný význam pre aktivovánie génu lL-18 BP interferónom IFNy.0023 Štartovacia miesto transkripcie ľudského lL-18 BPa mRNA sa stanovilo prostrednictvom 5 RACE. Bolo zistené, že 3 koniec mRNA proteínu s motívom Zn-prsta umiestnený upstream od génu IL-BBP týmto limituje potenciálnu upstream regulačnú sekvenciu IL-18 BPa na 1601 báz smerom upstream od bázy 1.0024 V rámci tohto regiónu bolo identifikovaných šest regulačných elementov (Obrázok 1) (od proximalneho konca transkripcie smerom k distálnemu koncu transkripcie) 1- gama-aktivované sekvencie (GAS) na úrovni báz -24 až -32, 2- IRF-1,2 odozvový element (IRF-E) obsahujúci bázy -57 až -69, 3- a 4- dva odozvove elementy na úrovni báz -309 až -322 a » 621 až -634, 5- silencer vo zvyškoch -625 až -1106, a 6- zosilňovaci element zahŕňajúci bázy -1106 až -1272. V HepG 2 bunkách (bunková línia z ľudského hepatocelulárneho karcinomu) sa otestovala seria Iuciferázových reporterových vektorov s progreslvnym skracovaním na 5 konci fragmentu s 1601 bázovými pármi (bp). Oblast s 1272 kb uvedená vSEQ lD No 1 riadi oboje, bazálnu expresiu pozorovanú vniektorých tkanivách abunkových typoch, ako aj indukciu prostredníctvom lFNy. Testovanie aktivity promótora na useknutých DNA fragmentoch idúcich po sebe v rámci tejto oblasti ukázalo,že DNA fragment so 122 bázovými pármi, ktorý je umiestnený proximálne vzhľadom na miesto začatia transkripcie, uvedený v SEQ ID NO 3 zahŕňa minimálny promótor. Tento minimálny promótor je aj indukovatelný. Avšak iné regulačné sekvencie umiestnené upstream od tohto minimálneho promótora tiež prispeli k rozsahu indukcie. Ukázalo sa, že DNA fragment so 635 bázovými pármi obsahujúci okrem IRF-1 a GAS elementov aj dva C/EBPB elementy uvedené v SEQ ID NO 2 poskytuje maximálnu indukciu expresie luciferázy prostrednictvom IFNy.0025 ln vivo experimenty urobené s myšami deñcitnými v IRF-1 potvrdili dôležitosť IRF-1 ako mediátora ako bazálnej expresie IL 18 BP, tak aj expresie indukovanej prostrednictvom lFNy.0026 Bolo zistené, že po indukcii s lFNy sa indukuje expresia faktora lRF~ 1 a tento faktor tvorí komplex na C/EBPB, ktorý je vbunkách konštitutívne prítomný. Komplex sa viaže na proximálny GAS promótorový element a na jeho susediaci IRF-E promótorový element.0027 Bolo zistené. že enhancer prítomný na distálnom konci miesta transkripcie interaguje s bazálnym promótorom prostredníctvom IRF-1.0028 vynález sa týka promótora lL 18 BP sekvencie SEQ lD N 021 alebo jeho fragmentu, a spôsobov regulácie génovej expresie. Osobitnejšie, vynález sa týka izolovaných DNA sekvencií IL-18 BP 1272 bp (SEQ lD NO.1) alebo ich fragmentu, ako napriklad 635 bp (SEQ ID NO 2) e 122 bp (SEQ lD NO 3), ktoré sú schopné riadiť génovú expresiu.0029 Táto promótorová oblast IL-18 BP bola naklonovaná a sekvenovaná a zodpovedá nukleotidom v 1271 bp upstream od miesta začatia transkripcie IL-1 BBP (SEQ ID NO 1).0030 vynález zahŕňa celý promótor IL-18 BP (SEQ ID N 01), ale aj sekvencie zahŕňajúce jeho fragment(SEQ ID NO 2, SEQ ID NOz 3), schopné riadiť transkripciu genov, atým vkonećnom dôsledku génovú expresiu, a možno ich použiť s inými časťami promótorovej oblasti lL-18 BP, alebo, alternatívnym spôsobom,s heterológnymi promotormi alebo s elementmi heterológnych promótorov na kontrolu transkripcie génov. Tento promótor alebo jeho fragment je schopný indukcie prostrednictvom lFNy. Táto indukcia sa môže ďalej0031 Funkčné deriváty promótora uvedené v SEQ lD N 011, alebo ich fragment, ako je napríklad SEQ ID NO 2 alebo SEQ ID NO 3, sú mutanty, vktorých 1 až 10, výhodne 1 až 5, výhodnejšie 1 nukleotid je nahradený iným, alebo je deletovaný, a ktoré sú schopné riadit expresíu genov a indukciu prostrednictvom IFNy.0032 sekvencie DNA podľa vynálezu zahŕňajúce promótor lL-18 BP (SEQ lD N 021) alebo ich fragment, ako napriklad fragment v SEQ lD NO 2 alebo SEQ ID NO 3, možno izolovat s použitím rôznych spôsobov, ktoré sú v problematike známe. Je možné použit aspoň tri alternatívne hlavné spôsoby(1) izolácia sekvencie DNA z genómovej DNA, ktorá obsahuje túto sekvenciu(2) chemická synteza sekvencie DNA, a(3) synteza DNA sekvencie polymerázovou reťazovou reakciou (PCR).0033 V prvom prístupe možno skrinovat knižnicu ľudskej genómovej DNA, aby sa identiñkovala sekvencie DNA zahŕñajúca promótor lL-18 BP alebo element promótora lL-18 BP.0034 V druhom prístupe sekvenciu DNA zahŕňajúcu promótor lL-18 BP alebo element promótora lL-18 BP možno syntetizovat chemicky. Napriklad sekvenciu DNA zahŕňajúcu promótorovú oblast IL-18 BP, alebo promótor lL-18 BP, možno syntetizovat ako sériu 100 bázových oligonukleotidov, ktoré možno sekvenćne pospájat (prostredníctvom vhodných terminálnych reštrikčných miest), aby sa vytvorila správna lineárna sekvencia nukleotidov.0035 Vtreťom pristupe sekvenciu DNA zahŕňajúcu promótorovú oblast IL-18 BP alebo promótor IL-18 ElP možno syntetizovat s použitím PCR. Stručne, páry syntetických DNA oligonukleotidov dlžky aspoň 15 báz(PCR primery), ktoré sa hybridizujú sprotilah|ými vláknami cieľovej sekvencie DNA možno použit na enzymatickú amplifikáciu intervenujúcej oblastijDNA na cieľovej sekvencii. Opakované cykly tepelnej denaturácie templátu, zocelenie primerov a predlženie 3-koncov zocelených primerov s DNA polymerázou

MPK / Značky

MPK: C07K 14/435

Značky: príprava, promótor, il-18bp, použitie

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/30-e6935-promotor-k-il-18bp-jeho-priprava-a-pouzitie.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Promótor k IL-18BP, jeho príprava a použitie</a>

Podobne patenty