Kvantitatívna detekcia HDV s využitím real-time RT-PCR

Číslo patentu: E 2058

Dátum: 06.08.2004

Autori: Gault Elyanne, Deny Paul, Le Gal Frédéric

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Tento vynález sa vzťahuje na špecifické činidlá (reagencie) na kvantitatívne stanovenie HDV a ešte špeciñckejšie na sledovanie virálnej záťaže HDV chronicky infikovaných pacientov.Vynález sa tiež vzťahuje na takéto kvantitatívne stanovenie.Vírus hepatitídy delta (HDV) vyvoláva ťažkú akútnu a chronickú hepatítídu v pacientoch,infikovaných predtým alebo súčasne vírusom hepatitídy B. Liečba spočíva V dlhodobom podávaní vysokých dávok alfa-ínterferónu (IFN) a jeho účinnosť sa obyčajne sleduje detekciou špecifického anti~HDV Ig M alebo HDV genómu V sére.Vírus hepatitídy delta (HDV) je vírusová častíca 36 nm, ktorá závisí na víruse hepatitídy B(HBV) na zhromažďovanie a rozmnožovanie viriónu. HDV častica pozostáva z kmhového jednovláknového genómu RNA nukleotídov 1,672 - 1,697 23, ktorý sa spája s dvomi virálnymi proteínmi, sHD a LHD za vzniku ribonukleoproteínu. V priebehu virálnej replikácíe prerastie cez hepatocytové endoplazmatícké retikulum a získava obal, v ktorom sú vložené povrchové antigény hepatitídy B (HBsAg). Extenzívna intramolekulárna komplementarita vedie k párovaniu bází a dáva genómu HDV pseudo-dvojvláknovú štmktúru 3 (Obr. 1). Extenzívne sekvenčné analýzy početných izolátov viedli ku klasifikácii HDV do aspoň 7 rozličných kmeňov s rozdielnymi geografickými distribúciamiz. Stručne povedané, HDV vírusy kmeňa l (C 1) (genotyp 1, ďalej nazývaný HDV-l) sa vyskytujú vo väčšine oblastí,kmene 2 a 4 (genotypy IIA aIIB označené ako HDV-2 aHDV-4) sa vyskytujú v ďalekovýchodných oblastiach, kmeň 3 (genotyp IH, HDV-3) na severe Južnej Ameriky akmene 5, 6 a 7 (HDV-5, HDV- 5 a HDV-7) v západnej Afrikez 4 (pozri tiež wo 03/027291).Infekcia HDV môže vyvolať ťažké ochorenie pečene, s fulminantnou hepatítídou,vyskytujúcou sa aspoň desaťkrát častejšie, ako pri samotnom HBV a miera chronickosti dosahuje v prípade superinfekcie 70 - 90 l s 9 V mnohých prípadoch sa chronická deltahepatitída vyvinie do cirhózy (60 - 70 a rakoviny pečene a účinnosť liečby vyvolávadávkach (27 MU týždenne) (čo je jediný režim, ktorý, ako sa zdá, zvyšuje dlhodobé prežívanie 14) na liečbu reagovalo len asi 50 pacientov a pri 40 z tých, čo reagovali,nastal relaps počas 6 mesiacov po ukončení terapie. Ani lamívudín, nukleozidovýfamcyklovir nie sú účinné pri kontrole infekcie HDV 17-19. Diagnóza infekcie HDV obyčajne spočíva V detekcii špecifických protilátok proti HDV v prítomnosti anti-HDVlgM, ktorá odráža pokračujúcu replikáciu vírusov. Aletomuto sérologíckému prístupu k detekcii vírusovej replikácie chýba citlivosť 20 °.Zhmutie vývoja markerov B a delta počas koinfekcií a superinfekcie je uvedenev medzinárodnej prihláška PCT W 0 03/027291.Antigén HDV je zriedkakedy zistený v sére, s výnimkou prípadu akútnej infekcie(pred sérokonverziou antigénu) alebo medzi chronický infikovanými pacientmi s ťažkou imunosupresiou 22. Preto replikácia HDV je najúčinnejšie vyhodnotená detekciou HDVRNA v sére s použitím vlastnými silami pripravených kvalitatívnych testov RT-PCRB. Hoci detekcia HDV-RNA v sére je obyčajne spojená s poškodením pečene a zlým výsledkom, neumožňuje to vyhodnotiť účinnosť liečby tak presne ako priPCR v reálnom čase poskytuje presné a citlivé prostriedky kvantifikácie virálnych genómov, pričom hlavnou výhodou je vyhnutie sa post-PCR spracovaniu, ktoré môže byť zdrojom prenosu DNA. Viaceré štúdie uvádzali výhody tejto techniky pre kvantifikáciu virálnych genómov vo vzorkách krvizóas. Nedávno T. Yamashiro a kol. vyvinuli test RTPCR v reálnom čase na kvantifikáciu HDV-RNA v sére a navrhli možnú koreláciu medzivirálnou záťažou a klinickou fázou ochorenia pečene. Priméry, používané T.Yamashirom a kol. boli založené na báze oblasti, konzervovanej medzi typmi l, 2 a a 2 bHDV genotypov. Preto tieto priméry neberú do úvahy ostatné genotypy HDV.Všeobecné princípy kvantitatívnej RT PCR v reálnom čase sú odborníkom známe a-3 PCR vreálnom čase založené na TaqMan® technológii umožňujú kvantifikáciu DNA alebo cDNA vo veľkom dynamickom rozmedzí (10 - 107 kópií) a dá sa preto dobre adaptovať na kvantifikáciu virálnych genómov. V prípade HDV sa vyžaduje také veľké rozmedzie kvantifikácie preto, ak uvážime, že u šimpanzov boli zistené veľmi vysoké virálne záťaže (počas akútnej fázy infekcie po priamej ínokulácíi pečene)36, afakt, že sledovanie po liečbe vyžaduje možnost stanovenia veľmi malých množstiev RNA. Okrem toho možnosť spracovania početných vzoriek a neprítomnosť post-PCR spracovania to robíbezpečným a pohodlným prístupom pre klinickú diagnózu.Ale žiadna z už navrhnutých metód nie je schopná detegovať s dobrou citlivosťou a vysokou špecifickosťou žiadny HDV genotyp vrátane typu 3 a nedávno opísaných typov 5,6 a 7.Okrem toho vývoj presného a citlivého testu pre HDV-RNA kvantiñkáciu vo vzorkách krvi vyvoláva dva technické problémy. Po prvé, tyčinkovitá štruktúra HDV 3, 37RNA, spôsobená intramolekulárnym párovaním bázi vyše 70 sekvencie má tendenciuovplyvňovať účinnosť syntézy cDNA a tým aj účinnost PCR. Po druhé, genetickávedie k špecifickému dizajnu primérov a sondy Skutočne, odlišnosť medzi typmi HDV, ako bolo preukázané, je až 37 v celej nukleotidovej sekvenciiVynálezcovia si preto dali za cieľ získať činidlá HDV nukleovej kyseliny, ktoré by boli schopné použitia pn kvantifikácii HDV-RNA všetkých typov HDV v sére infikovaných pacientov. Kvantiñkácia HDV-RNA v sére s činidlami podľa tohto vynálezu,vybranými z ribozymov, predstavovala neočakávane zlepšenie pre ďalšie sledovaniepacientov oproti doterajšiemu stavu.Skutočne, priméry a sonda, navrhnuté v týchto oblastiach, napriek silným sekundárnym štruktúram, ktoré obsahovali, viedli k zvýšeniu účinnosti PCR nad 93 .Okrem toho to pomôže pochopit prírodnú históriu infekcie HDV a definovaťpostupy pri liečbe chronickej delta hepatitídy.Tento test bol, neočakávane, dostatočne citlivý na to, aby detegoval 100 kópií HDV-RNA v 1 ml séra, bol reprodukovateľný a bol účinný pri detegovaní genómu všetkých typov HDV, vrátane typu 3 a nedávno opísaných typov 5, 6 a 7. Stanovenie virálnej záťaže liečených pacientov by pomohlo odlíšiť reagujúcich od nereagujúcich na IFN terapiu s väčšou presnosťou ako pri bežnom kvalitatívnom pristupe alebokvantitatívnom pristupe, založenom na použití primérov, zvolených V delta antigénovejPredmetom tohto vynálezu je preto spôsob detekcie HDV-RNA v biologickej vzorke,ktorý sa vyznačuje tým, že zahŕňal. krok extrakcie HDV~RNA z biologickej vzorky a2. krok vyhodnotenia množstva tejto HDV-RNA spôsobom kvantifikácia v reálnom čase RT-PCR, zahŕňajúcej- amplífikáciu jej zodpovedajúcej cDNA v prítomnosti aspoň páru primérov, zvolených zo skupiny, skladajúcej sa z týchto párova) Delta-F (priamy primér) SĽGCATGGTCCCAGCCTCCJ(SEQ ID N 021) a Delta-R (reverzný primér) 5-TCTTCGGGTCGGCATGG-3(SEQ ID NO 2) a b) T 3-Delta-F (priamy primér) 5-GCATGGQCCCAGCCTCC-3(SEQ ID N 013) a Delta-R (reverzný primér) T-TCTTCGGGTCGGCATGG-ť (SEQ ID NO 2). Vzhľadom na existenciu nesprávneho spojenia so sekvenciami genómu typu III ,druhý priamy primér bol špecificky navrhnutý pre ampliñkáciu izolátov HDV-3 T 3-De 1 ta-F 5-GCATGGCCCCAGCCTCC-3(SEQ ID N 023) preto možnovýhodne použiť vyššie uvedené dva páry primérov súčasne a- detekcia množstva vytvorených amplicónov a porovnanie uvedeného množstva sPodľa výhodného použitia tohto spôsobu krok detekcia je uskutočnený v prítomnosti fluorogenickej sondy Delta-P(sonda) deñnovanej touto sekvencíou

MPK / Značky

MPK: C12Q 1/70

Značky: využitím, rt-pcr, kvantitatívna, detekcia, real-time

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/30-e2058-kvantitativna-detekcia-hdv-s-vyuzitim-real-time-rt-pcr.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Kvantitatívna detekcia HDV s využitím real-time RT-PCR</a>

Podobne patenty