Umelá DNA sekvencia s optimalizovanou úlohou v 5′ (5′-UTR) na zlepšenú expresiu heterológnych proteínov v rastlinách

Číslo patentu: E 19353

Dátum: 27.12.2007

Autori: Patti Tamara, Marchetti Stefano, De Amicis Francesca

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

1 Umelá DNA sekvencia s optimalizovanou vedúcou úlohou V 5 (5 -UTR) na zlepšenú expresiuOblasť techniky 0001 Predložený vynález sa týka umelej DNA sekvencie na zlepšenie expresie0002 Voblasti biotechnológie je vnímaná silná potreba zvýšiť hladinu expresie génov,vnesených do príbuzných organizmov. Táto hladina je často nedostačujúca a bráni priemyslovej aplikácii inovácií v rastlinnej a živočíšnej biotechnológii. Z veľkého množstva dát, tykajúcich sa regulácie génovej expresie, vyplýva dôležitosť vedúcej oblasti, pričom jej regulačnú kapacitu charakterizujú rôzne štruktúrne elementy.0003 Neprekladaná vedúca sekvencia na 5 konci (5 °-UTR), ako je navrhovaná u bežne používaných vektorov (napr. pBI 12 l a jeho derivátov, pCAMBIA a jeho derivátov), má rad nedostatkov, vplyvom ktorých nie je vhodná na riadenie odpovedajúcich hladín génovej exprese v geneticky modifikovaných organizmoch. Ak je treba maximalizovat výťažky(napr. v prípade použitia vrastlinách, využívaných ako bunkovej továrne zlúčenín,pre človeka užitočných), je najmä nevyhnutné eliminovať tie elementy sekvencie 5-UTR,ktoré spôsobujú potlačenie produkcie. Doteraz sa v rastlinách používala vedúca sekvencia Q(sekvencia, ktorá sa prirodzene vyskytuje vo vírusu tabakovej mozaiky, TMV). Avšak i táto sekvencia vykazuje nedostatky, čo otvára možnosti zlepšenia.0004 Je známe, že po 1 y(CAA) oblasť translačného enhancera, prítomného vo vedúcej sekvencii Q TMV (Gallie a Walbot, 1992, Nucleíc Acids Res., 20, 4631-4638), významne zvyšuje hladiny expresie, čo znamená, že má pozitívny vplyv na hladiny translácie heterológnych proteínov in vitro a in vivo (Gallie a kol., l 988 a, Nucleíc Acids Res., 16, 883893, Gallie a kol., l 988 b, Nucleíc Acids Res., 16, 8675-8694, Gallie, 2002, Nucleíc Acids Res., 30, 3401-3411). Vo vedúcej sekvencii Q je sekvencia po 1 y(CAA) asociovaná s 3 repetíciami sekvencie ACAATTAC (Gallie a kol., l 988 a), ale delekné štúdie ukázali, že regulačný element, zodpovedný za zvýšenie hladín expresie, môže pozostávat len z jednejkópie sekvencie ACAATTAC v kombinácii s motívom (CAA)n (Gallie a Walbot 1992).-2 0005 Rovnako je známe, že iníciačné transkripčne miesto (Inr) promótora 35 S CaMV(Guilley a kol., 1982, Cell, 30, 763-773) preferuje účinné čapíčkovanie mRNA.0006 Ďalej je rovnako známe, že mnoho rastlinných vedúcich sekvencií (Bolle a kol., 1996,Plant Mol. Biol. 32, 861-868) je bohatých na CT elementy a že tieto CT bohaté sekvencie môžu menit transkripčné hladiny (Chen a kol., 1996, J. Virol., 70, 8411-8421).0007 Tiež je známe, že sekvencíe dlhšie než 40 nukleotidov podporujú rozpoznanie prvého kodónu AUG ako pôvodného iniciačného translačného kodónu (Kozak, 1989, J. Cell. Biol.,108, 229-241). Napríklad pozorovalo sa, že predlžovanie vedúcej sekvencie od 24 do 74 nukleotidov spôsobuje zvýšenie hladiny translácie mRNA in vitro (Kozak, 1991, J. Biol. Chem., 266, 19867-19870) i in vivo (Gallie a Walbot 1992). Vedúce sekvencíe svyšším obsahom A/T spôsobujú zvýšenie hladiny expresie, pretože vplyvom zvinutia (foldingu) molekuly dochádza k narušeniu vzniku segmentov dvojreťazcovej mRNA. Je známe, že tieto sekundárne štruktúry znižujú účinnosť translácie (Pelletier a Sonenberg, 1985, Cell, 40, 515526 Kozak, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2850-2854). Ďalej sa zaznamenalo, že vnesenie častí sekvencií 5 °-UTR vírusového pôvodu do rastlinných vedúcich sekvencií môže spôsobiť zvýšenie expresnej hladiny reportérových proteínov (Dowson Day a kol., 1993,Plant Mol. Biol., 23, 97-109).0008 Účelom predloženého vynálezu je teda odstrániť nedostatky stavu techniky a získať vedúcu sekvenciu, ktorá zvyšuje expresné hladiny rekombinantných proteínov V rastlinách. 0009 Prihlasovateľ navrhol, otestoval a opísal predložený vynález, ktorý prekonávanedostatky stavu techniky a ktorý má tieto a ďalšie ciele a výhody.0010 Predložený vynález je opísaný a charakterizovaný nezávislými nárokmi, zatiaľ čo závislé nároky opisujú ďalšie vlastností predloženého vynálezu alebo varianty hlavnej vynálezcovskej myšlienky.0011 V súlade s vyššie opísaným účelom zahmuje umelá DNA sekvencia podľa predloženého vynálezu s vedúcou úlohou v 5 ° (SĽUTR), označovaná tu v texte LL-TCK, viac elementov príaznivých pre génovú expresiu, napríklad repetície trinukleotidových elementov CAA v kombinácii s repetíciami dinukleotidových elementov CT, súčasne.0012 Sekvencia LL-TCK podľa predloženého vynálezu sa získala umelou syntézou a je0013 Sekvencia LL-TCK podľa predloženého vynálezu poskytuje kombináciu trinukleotidových elementov CAA s dinukleotidovými elementmi CT a modiñkáciu transláeie aktivujúcich sekvencií, prítomných vo vedúcej sekvencii Q.0014 Sekvencia podľa predloženého vynálezu obsahuje poly(CAA) oblasť, čo je oligonukleotid, pozostávajúci z 9 alebo viacerých kópií elementu CAA, ktoré spolu s výhodou, ale nie nevyhnutne, susedia.0015 Sekvencia podľa predloženého vynálezu obsahuje poly(CT) oblasť, čo je oligonukleotid, pozostávajúci zo 4 alebo viacerých kópií elementu CT, ktoré spolu s výhodou,ale nie nevyhnutne, susedia.0016 Predložený vynález poskytuje sekvenciu, ktorá obsahuje jednu alebo viacero kópií oktaméru ACAATTAC.0017 Do rozsahu predloženého vynálezu rovnako spadá sekvencía, získaná kombináciou sekvencií s poly(CAA) oblasťou a sekvenciou s poly(CT) oblasťou.0018 Do rozsahu predloženého vynálezu rovnako spadá sekvencía, získaná kombináciou sekvencií s poly(CAA) oblasťou a sekvenciou s jednou alebo viacerými kópiami oktaméru ACAATTACC.0019 Do rozsahu predloženého vynálezu rovnako spadá sekvencía, získaná kombináciou sekvencíí s poly(CT) oblasťou a sekvenciou s jednou alebo viacerými kópiami oktaméru ACAATTACC.0020 Podľa predloženého vynálezu je poskytnutá sekvencía, získaná kombináciou sekvencií s poly(CAA) oblasťou, sekvenciou s poly(CT) oblasťou a sekvenciou s jednou alebo viacerými kópiami oktaméru ACAATTACC. Ďalej, opäť podľa predloženého vynálezu, je možno poskytnúť sekvenciu, získanú kombináciou jednej alebo viacerých vyššie uvedených sekvencii smiestom Inr 35 S CaMV, čo je iniciačné transkripčné miesto promótora 35 S karñolového mozaikového vírusu.0021 Sekvencia LL-TCK podľa predloženého vynálezu je takto schopná zvýšiť expresné hladiny heterológnych proteínov vtransgénnych rastlinách. Podľa výhodného riešenia predloženého vynálezu sa syntetizovala nová jedinečná sekvencia LL-TCK, vytvorenákombináciou nasledujúcich elementov podľa pôvodnej štruktúry(l) iniciačného transkripčného miesta (Inr) promótora 35 S CaMV pre účinné čapičkovanie mRNA(3) sekvencie bohaté na CT elementy, ako V mnohých rastlinných vedúcich sekvencíách.0022 Sekvencia LL-TCK je dlhá viac než 40 nukleotidov, aby podporovala rozpoznanie prvého kodónu AUG ako pôvodného iniciačného translačného kodónu (Kozak 1989), a má celkový obsah GC nižší než 40 .0023 Sekvenciou LL-TCK je podľa konkrétneho riešenia predloženého vynálezu sekvencia,označená ako SEQ ID NO 1 (5 °-3 °).0024 Dá sa predpokladať, že malé mutácie sekvencie LL-TCK nezmenía jej účinnost a preto sa predložený vynález týka rovnako vedúcich sekvencíí odvodených od predloženej sekvencie, napríklad deléciou alebo duplikáciou tripletu CAA, substitúciou alebo deléciou jednej bázy atď.0025 Inovácia LL-TCK pozostává z faktu, že modifikovaný element poly(CAA), oktamér z vedúcej sekvencie Q TMV a CT-bohatá sekvencia rastlinného pôvodu sú spojené do jednej vedúcej sekvencie.0026 Umelá sekvencia LL-TCK podľa predloženého vynálezu poskytuje prítomnosť jedného oktaméru ACAATTAC asociovaného s 9 repetíciami CAA, umiestnenými v polohe 5 vzhľadom k oktaméru.0027 Vzhľadom k tomu, že triplet ATT vnútri elementu ACAATTAC môže reprezentovať nekanonické iniciačné translačné miesto (Tyc a kol., 1984, Eur. J. Biochem., 140, 503-511,Schmitz a kol., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 257-263), je tento triplet vo vedúcej sekvencíí LL-TCK umiestnený in frame so stop kodónom.0028 Ďalej bol do umelej vedúcej sekvencie LL-TCK, na 3 koniec regulačného elementu,získaného spojením oktaméru ACAATTAC so sekvenciou poly(CAA), pridaný element(CT)4. Oba uvedené elementy majú pozitívny vplyv na genovú expresiu a ich kombinácia nebola v prírode doteraz nájdená ani človekom vytvorená.0029 Vedúca sekvencia LL-TCK, kombinujúca tieto dva elementy, spôsobuje zvýšenie translačnej hladiny i transkripčnej hladiny zvažovaného génu.0030 Tento účinok bol preukázaný zrovnaním hladín expresie génu uídA v rastlinách tabaku(Nicotíana tabaccum), transformovaných konštruktamí 35 S-LL-TCKuidA (pSTART) a 35 ~SzzuidA (pBll 2 l s pôvodnou vedúcou sekvenciou). Vektor pSTART sa získal nahradením vedúcej sekvencie v pBll 2 l (Clontech) sekvenciou LL-TCK. Cieľom nahradzovania a manipulácie bola sekvencia pBll 2 l, zahmujúca sekvenciu medzi oblasťouInr (ACACG) a reštríkčným miestom enzýmu Xba I (TCTAGA). Nukleotidová sekvencia,

MPK / Značky

MPK: C12N 15/82, A01H 5/00

Značky: expresiu, proteínov, úlohou, optimalizovanou, sekvencia, zlepšenú, rastlinách, heterológnych, umělá, 5'-utr

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/30-e19353-umela-dna-sekvencia-s-optimalizovanou-ulohou-v-5-5-utr-na-zlepsenu-expresiu-heterolognych-proteinov-v-rastlinach.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Umelá DNA sekvencia s optimalizovanou úlohou v 5&#8242; (5&#8242;-UTR) na zlepšenú expresiu heterológnych proteínov v rastlinách</a>

Podobne patenty