Transplastomické rastliny neobsahujúce gén pre selektovateľný marker

Číslo patentu: E 10370

Dátum: 03.01.2006

Autori: Tissot Ghislaine, Ferullo Jean-marc, Dubald Manuel

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

Predložený vynález sa týka transplastomických rastlín neobsahujúcich gén pre selektovateľnýmarker, spôsobu získania týchto rastlín a použitých vektorov.Transgenéza rastlín spočíva vo vnesení jedného alebo viacerých génov pochádzajúcich z rôznych organizmov (baktérie, vírusy, hmyz, rastliny) do rastlín s cieľom zaistiť im nové vlastnosti a zlepšiť niektoré ich agronomické alebo nutričné kvality. Veľká rôznorodost génov spojených svývojom klasických techník genetickej transformácie viedla k vzniku nových rastlinných variet. V niektorých prípadoch je možné vďaka vneseniu charakteristík zaisťujúcich odolnost voči herbicídu, patogénom alebo rôznym typom stresu uľahčiť pestovateľskú prax a zvýšiť výnosy. V iných prípadoch je možné zlepšiť nutričnú hodnoturastliny a obsah niektorých jej zásadných zložiek.Množstvo spôsobov získania stabilných transgénnych rastlín je založená na vnesení cudzorodćho génu do jadrového genómu rastliny. Cudzorodé gény vložené do jadrových chromozómov hostiteľskej rastliny sa však môžu šíriť peľom do divokej populácie. Spôsobyznižujúce riziko prenosu transgénov do okolia sú teda veľmi užitočné.Iným spôsobom získania transgénnych rastlín je priama transformácia plastidov.Transformácia plastidov má mnoho špecifických výhod, medzi ktorými je možné spomenúť- Transformáciu plastidov, pri ktorej sa gény vnesú dvojitou homológnou rekombináciou do jednej alebo viacerých kópií kruhovćho genómu plastidu (alebo plastómu) prítomného vkaždej bunke, má výhodu presného zacielenia oblasti plastómu, do ktorej má byt požadovaný gén vnesený, pomocou plastidových sekvencií umiestnených po obidvoch stranách transgénu vtransformačnom vektore. Týmto presným zacielením sa zabráni pozičnému efektu zvyčajne pozorovanému pri- Získanie veľmi vysokého počtu kópií transgénu na bunku. Konkrétne, listová bunka môže v závislosti od vývojového štádia obsahovať až 10 000 kópií malého kruhovéhogenómu s 120 až 160 kilobázami, pričom každá molekula obsahuje veľkú repetitívnusekvenciu. Rastlinné bunky je potom možné upraviť tak, aby obsahovali až 20 000 kópií požadovaného génu. Týmto sa dosiahnu vysoke úrovne expresie produkty transgénov tak môžu predsta vovať viac ako 40 celkového obsahu rozpustných proteínov (De Cosa a kol., 2001).- Transformácia plastidov má tú ďalšiu výhodu, že vysoko obmedzuje riziko šírenia transgénu do okolia. Pretože Charakteristiky kódované plastidmi všeobecne nie je možné šíriť peľom, potenciálne riziko prenosu transgénu na divoké druhy jeTechniky transformácie plastidov sú opísané V článku autorov McBride a kol., 1994,vpatentoch USA č. 5 451 513 5 545 817 5 545 818 a 5 576198 a tiež vpatentových prihláškach W 0 95/ 16783 a W 0 97/32977. Biolistická transformácia plastidov bola pôvodne uskutočnená V jednobunkových riasach Chlamydomonas reinhardtií (Boynton a kol., 1988) atento spôsob bol potom rozšírený na tabak (Svab a kol., 1990).Konvenčne techniky transformácie plastidov sú založené na bombardovaní listov mikro projektilmi, na ktorých je uchytená DNA (Svab a kol., 1993).Vsúčasnosti sa stabilná transformácia plastidov vyšších rastlín bežne uskutočňuje iba v rastlinách tabaku N. tabacum (Svab a Maliga, 1990 Svab a kol., 1993). Určítý pokrok sa však dosiahol pri transformácii plastidov z ryže (Khan a Maligna, 1999), Arabídopsis thaliana(Sikdar a kol., 1998), zemiakov (Sidorov a kol., 1999), repky (Chaudhuri a kol., 1999) a paradajok (Ruf a kol., 2001). Množivé transplastomické rastliny sa získali pri tabaku, paradajkách a sóji (W 0 04/053133).Priama transformácia plastidov sa používa na získanie dobrej úrovne tolerancie na herbicídy alebo rezistencie voči hmyzu, alebo tiež na produkciu proteínov vo veľkých množstvách. Nadmerná expresia génov tabakového plastómu na toleranciu na herbicídy ako napr. glyfozát(Daniell, 1998 W 0 99/10513 Ye a kol., 2000 W 0 01/04331, W 0 01/0432) alebo fosñnotricín (Basta) (Lutz a kol., 2001) zaisťuje výbornú toleranciu voči týmto herbicídom. Ďalšie aplikácie viedli k produkcii transplastomických rastlín s toleranciou voči hmyzu alebo so zvýšenou produkciou terapeutických proteínov (McBride a kol., 1995 US Patent 5,451,513 Staub a kol. (2000), W 0 99/10513).Jednou z hlavných nevýhod priamej transformácie plastidov vyšších rastlín, tak ako sa zvyčajne uskutočňuje, je však použitie génov na rezistenciu na antibiotikum ako selektovateľ ného markera.Všeobecne použivaným selektovateľným markerom na selekciu línii transplastomických rastlín je bakteriálny gén aadA, ktorého expresiu riadia plastidové regulačné elementy (Svab a kol., 1993 Staub a kol., 1993). Expresia génu aadA, ktorý kóduje aminoglykozid-ľadenylyltransferázu, zaisťuje rezistenciu voči dvom antibiotikám, spektinomycinu a streptomycínu. Produkt génu aadA bráni väzbe spektinomycínu (alebo streptomycinu) na 16 S RNA, zložku 308 podjednotky plastidových ribozómov, podieľajúcu sa na rozpoznávaní translačného iniciačného kodónu, a teda inhibícii translácie v plastide. Iba bunky obsahujúce plastidy exprimujúce produkt génu aadA budú schopné pokračovať v optimálnom raste in vitro a zostávať zelené. Iným selektovateľným markerom je sekvencia 16 S RNA, ktorá nesiebodovú mutáciu umožňujúcu potlačenie citlivosti na spektinomycin.Toto antibiotikum však tiež potláča bakteriálne infekcie u človeka a živočíchov. V dôsledku toho sú značné obavy spojené spotenciálnymi rizikami pre zdravie a životné prostredie spojené sprítomnosťou génu pre rezistenciu na antibiotikum vtransgénnych plodinách. Spôsoby umožňujúce odstrániť gény pre selektovateľné markery, konkrétne gény pre antibiotikové markery, pri súčasnom zachovaní požadovaného génu v transgénnej rastline, súBol opísaný určitý počet viac alebo menej komplikovaných spôsobov ako odstrániť gén pre selektovateľný market, ktorý je integrovaný do chromozómov. Ak gén pre market nie je geneticky viazaný na požadovaný gén, je možné dúfať, že je ho možne vyradiť križenim a analýzou potomstva. Ak je gén pre selektovateľný marker geneticky viazaný, je možné použiť iné spôsoby, ako napr. spôsoby založené na použití transpozibilných elementov(PCT/US 91/O 4679 Yoder a kol. 1994) alebo na použití miestne špecifických rekombinačných systémov, ako napr. systém cre/lox bakteriofága Pl alebo kvasinkový systém FLP/FRTMiestne špecifická rekombinácia sa tiež používa na odstránenie génu pre markettransplastomických rastlín vnesením druhého transgénu kódujúceho proteín CRE cielený dochloroplastov prostredníctvom jeho ttanzitného peptidu (EPl 218488). Prítomnosť proteínu Cre môže napriek tomu viesť k ďalšej škodlivej dráhe tekombinácíe C re (HajdukiewiczV riasach C. reinhardtii umožnili spôsoby selekcie založené na fotosyntetických mutantoch vnesenie požadovaných cudzorodých génov do plastidového genómu bez použitia génov pre selektovateľný antibiotikový market, ako napr. aadA. Tieto spôsoby Však nie je možné použiťpri vyšších rastlinách, pretože sú založené na existencii fotosyntetických mutantov.Na následné odstránenie časti transgénu, konkrétne selektovateľného marketa, je možné tiež použit dvojitú homológnu tekombináciu, ktorá tvorí základ transformácie plastidového genómu. Princíp tejto eliminácie bol opisaný pri riasach Chlamydomonas (Fischer a kol.,1996) a pri tabaku (W 0 01/81600). Táto používaná technika spočíva vtransfonnácii plastidového genómu sekvenciou nukleovej kyseliny zahŕňajúci požadovaný gén a gén pre selektovateľný market ohtaničený dvoma totožnými sekvenciami DNA, v rovnakej orientácii,a dostatočne dlhými na aktiváciu homológneho tekombinačného systému. Výsledky transformácie sa selektujú kultiváciou vptvom selektovateľnom médiu zodpovedajúcom použitému génu pre selektovateľný market. Kalusy sa namnožia v selekčnom médiu, aby sa získali homoplazmické rastliny, vktorých všetky plastidové genómy obsahujú gén pre selektovateľný market a požadovaný gén. Tieto rastliny a ich potomstvo sa potom kultivujú vneselektívnom médiu, aby bolo možné uskutočniť odstránenie génu pre selektovateľnýmarket, zatiaľ čo jedna z priamych repetitívnych sekvencií zostane po rekombináciiSystém na selekciu rastlín s odstráneným génom pre market sa používa pri Arabidopsis, ale týka sa transformácie jadrového genómu (W 0 01/96583). Pri tomto spôsobe sa rastliny ttansfotmujú pomocou vektota, ktorý zahŕňa dve kópie požadovaného génu vrovnakej orientácii ohraničujúce gén pre pozitívny selektovateľný market a gén pre negatívny selektovateľný market. Gén pre pozitívny selektovateľný market umožňuje selektovať výsledky so zabudovaným transgénom V genóme. Prítomnosť dvoch kópií požadovaného génu umožňuje odstrániť pomocou homológnej tekombinácie obidva (pozitívny aj negatívny) gény pre selektovateľný market a tiež jednu z dvoch kópií požadovaného génu. Rastliny,ktoré prešli touto homológnou tekombináciou, sa potom selektujú kultiváciou s negatívnymselektovateľným markerom zabraňujúcim rastu buniek, ktoré stále obsahujú gén pre

MPK / Značky

MPK: C12N 15/82, A01H 5/00

Značky: rastliny, transplastomické, marker, neobsahujúce, selektovateľný

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/30-e10370-transplastomicke-rastliny-neobsahujuce-gen-pre-selektovatelny-marker.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Transplastomické rastliny neobsahujúce gén pre selektovateľný marker</a>

Podobne patenty