Způsob štěpení dvojvláknové DNA v kterémkoliv daném bodě

Číslo patentu: 238646

Dátum: 15.05.1987

Autori: Miozzari Giuseppe, Yansura Daniel, Heyneker Herbert, Kleid Dennis

Je ešte 22 strany.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Způsob štěpení dvojvláknové DNA v kterémkoliv daném bodě spočívající v tom, že a) dvojvláknová DNA se převede v okolí obklopujícím daný bod na jednovláknovou DNA, b) na jednovláknový úsek vytvořený ve stupni a) se hybridizuje komplementární délka jednovláknového DNA priméru, přičemž 5´ konec priméru leží na opačné straně nukleotidu připojeného k zamýšlenému štěpícímu místu, c) obnoví se ta část druhého vlákna eliminovaného ve stupni a), která leží v 3´ směru od uvedeného priméru, reakcí s DNA polymerázou v přítomnosti trifosfátů desoxynukleotidů obsahujících adenin, thymin, guanin a cytosin a d) digeruje se zbývající jednovláknová délka DNA, která vyčnívá za zamýšleným štěpícím místem.

Text

Pozerať všetko

Nástup technologie využívající rekornbiIlované kyseliny desoxyribtmukleovér DNA umožnil kontrolovano-u bakteriální produikci enoirmní řady užitečných polypeptidů. V současné době jsou již k dispozici baktérie modifikované touto technologií,které umožňují výrobu takových polypeptidických produktů, jako jsou somatostatin viz K. Itakura a spoluąpracovníci, Science 198, 1058 /1977/, komponenty A a B řetězců lidského insulinu viz D. V. Goeddel a spolupracovrníci, Proc. Naťl. Acad. Sci., USA 76,106 /1979/1 a lidský růstonvý hormon viz D. V. Goeddel a spolupracovníci, Nature 281,544 /1979/. Nověji bylo rekotmbinačních DNA technologií použito k bakteriálni produkci thymosinu alfa 1, imunopotenciačni substance produkova-né thyunem publik-ovaná přilhláška evropského patentu č. 00354541.Význam této technologie je tak velký, že bakteriálně lze skutečně vyrábět každý potřebný polypejptid, přičemž je v dosahu kontrolovaná výroba hormonů, enzymů, protilátek a vakcin proti nejrůznějšim onemocněnírn. Citované publikace, ve kterých jsou podrobněji popsány shora uvedené typické příklady -bakteriální výroby polypeptidů,jsou na tomto místě uváděny, stejně tak, jako další níže uvedené publikace, za účelom bližšího objasnění podstaty vynálezu.výkonným útvarem rekombinační DNA technologie je plasmid, chr-omosomů prostá smyčka dvouvláknové DNA znalezená v bakteriích, často v Innohonásobných kopiích v jedné bakteriální buňce. V informaci zakódovarné V plxasmidické DNA jest včleněna informace potřebná ik reprodukci plasmidu do dceřinné buňky tzv. rep 1 ikón a obvykle jedna nebo více selekčních charakteristík,jako je rezistence vůči a-ntibiotikům, které umožňují, že klóny hostitelské buňky obsahující plasmid, který je předmětem našeho zájmu, mohou být rozpoaznány, selektivně vybrány a přednostně pěstovány v selektivním růstoivém prostředí.Užitečnost balkteriálních plasmldů spočíva ve skutečnosti, že je lze speciiicky štěpit jednou nebo druhou restrikční endonukleázou, neboli restrikčním enzymem, přičemž každá z těchto endonukleáz rozpoznává na xplasmidické DNA odlišné míst-0. Po rozštěpení lze vpravit do plas-midu heterologické geny nebo fragmenty genů bud přimým připojením v místě rozštěpení, nebo připojením na rekonstruovaných koncích sousedících s místem rozštěpení. Pod pojmem heterol-ogický používaným v popisu vynálezu se rozumí gen, který se obvykle nenacházi v bakteriích E. coli, nebo polypeptidické sekvence, lkterá není těmito bakteriemi obvykle produkována, zatímco pojem homo 1 ogický se xvztahuje na gen neho polypeptid, který je produkován divoce rostoucím typem bakterií E. coli. Rekombinace DNA se provádí vně baktérií, ale vzniklý rekombinovaný plasmiud lze zavésti do baktérií postupem známým jako transformace a kultivací zís 4kaného transformantu lze připravit velká množství rekombinovanéaho plasmidu obsahujícího heterologický gén. Kromě toho, podle toho kam se gen vhodné zavede vzhledem Ik částem plasmidu, které řídí transkripci přepis .a translaci překlad zakódovaných DNA informací, lze získaný vylučovací prostředek použít k .aktuální produkci polypeptidické SGKNBHCB, pro kterou je Vestavěný gén kódován tento postup se v popisu vynálezu označuje jako vylučováni expreseLExprese je iniciována v oblasti známé jako promotor, která se vyznačuje tím, že je místem připojení RNA-polymerazy. V některých případech, jako v níže dislkutovanem případu tryptofánového trp operónu, jsou oblasti promot-oru překryty oblastmi operátoru a vytváří se kombinovaný promotor-operátor. Operátory jsou sekvence DNA, které lze rozpoz-nat prítomnosti tak zvaných represorových yproteiiíů, které slouží k regulování frekvence iniciace transkripce u specifickěh-o promotoru. Pvolymerasa se pohybuje podél řetězce DNA, transkribuje informace obsažené v kódovacím vláknu DNA z jeho 5 místa na 3 konec informační kyseliny ribonukleové m-RNA a tyto informace ihned přelkládá do polypeptidické sekvence, která má takové pořadí aminokyselín, které je v DNA zaködované. Každá aminokyselín je zakódována jediným tripletem nukleotidů,neboli kodónem, pro který je V popisu vynálezu používán termín strukturálni gen a označuje tu část DNA, ve které je zakódována sekvence aminokyselín vyloučeného peptidického produktu. Poté, co se RNA-polymeráza naiváže na promotor, transkribuje nejprve nwkleotidy kódováním ina rivbnozóníové VElZebHŠ místo, pak dojde k iniciaci translace neboli k signálu start obyčejně kodóí-nem ATG, který se ve vzniklé informační RNA stane AUG a poté k translaci nukleotidických kodónů. do samostatného strukturálnĺho genu. Na konec strukturálního genu se transkribují tak zvané stop-kodóny a polymeráza může pote vytvářet další sekvenci informační RNA, lkterá vzhledem k přítomnosti stop-signálu zůstává nepřenesena do ribozómíi. Ribozómy se naváží na vazebné místo pripravené na informační RNA, v bakteriích obvykle pote, co se mRNA vytvoří, a samy produkují polypeptidy podle zakódované sekvence, počianaje start signálem translace a konče zmíněným st-op signálom. Žádaný produkt se tvoří jen tehdy, když jsou sekvence kÓdlljĺCÍ vazebné místo ribozómů Lunistěny správně vzhledem k AUG iniciačnírmu kodöníi a když všechny zbývvající kodóny následují za iniciačním kodönem ve fázi. Vzniklý produkt lze zíslkat lýzou hostitelské buňky a jeho oddělením od ostatních bílkovin vhodnou čistící metodou.Polypeptidy získa-né expresí za použití rekombinační DNA technologie mohou být zcela heterologické, jako v případě přímého vylučování lidského růstového hormonu, 238646nebo se alternatilvně mohou skladat z heterologického polypeptidu, na který je naväzána fúzována alespoň část aminokyselinove sekvence homologického ąpeptidu, jako v případě prípravy meziprodttktů pro somatostin a složek lidského insulinu. V posléze uvedeném případu obsahuje například thomologický peptid navázanou část amin-okyselinove sekvence pro betagalaktosidáztt. V takovýchto případech je žádaný bioaktivní produkt biologicky in-aktivován navázarnýní homologickým polypeptidem do té doby, dokud není posléze uve-dený peptid odštěpen působením extracelulárních prostředků. Fuzov-ane bíllkoiviny, jako ty, které byly zmíněny výše, lze pokládat za prekursory žádaných bílkovin, ktere se z nich dají získat vysoce specitickým štěpettím, jako například působením bromkyanu obsahují-li methionin, neb-o alternatívne enzymatickým štěpením viz například britský patent 2007676 A..Má-li rekombinační DNA technologie splnit očekávane naděje, musí se nalezti systémy, které optimalisují expresi vložených genů a umožňují získávat žádané povlypeptidícké produkty ve vysokých výtěžcích. Beta-laktamázové a laktozové pr-omotor-operátorové systémy, kterých se v minulosti nejběžněji používalo, poněvadž byly užitečné,neuvyužívaly .plně kapacitu technologie z tbl-ediska výtěžků. Bylo~ třeba nalézti pr-ostředek pro bakteriální vylučování pepti-dů, který by umožňoval kontrolovateln-ou expresí žá-daných polypeptidických produktů ve vysokých výtěžcích.Tryptorfan je aminokyselina produkovaná bakteriemi a používaná jimi jalko komponenta homologických polypexptldů. Blosynthesa probíhá následujícím způsobem kyselina chorismovakyselina antranilová - kyselina fosforibosylantranilová - CDRP enol-l-o-k-arboxyfenylamino-1-des 0 xy-D-ribulosta-S-tostát 1 - indol-S-glyceroltosfát a posléze samotný tryptotan. Enzymaticke reakce této biosyntezy jsou katalysovány produkty tryptofávnového -operónu, což je polycitronový úsek DNA, který je transkribován pod řízením trp-promotorotrého-operátoro»vého systému. Vznikla polycistrónová informační RNA kóduje tak zvane hlavní tryptofanové sekvence a palk, v níže uve-deném lPOřadí, polypeptidy označované zde jako trp E» trp D, trp C, trp B a trp A. Tyto polypeptidy v různé míře katalysují a kontrolují individuální stupně blosýntesy tryptofanu z kyseliny ch-orismové.V divokém typu bakteirií E. coli je tryptotânový operón pod vlivem alespoň tří různýcah forem regulačních kontrol. V případě represe promotoru-»operátoru působí sám tryptofan jak-o korepresor, váže se na svůj aporepresor a vytváří aktivní represorový komplex, který se ihned pote váže na operátor a ukončuje biosyntesu V jejím celku. Za druhé, mechanismem inhibice zpětné vazby, se tryptuofan váže na komplex trp Ea trp D polypeptidů a zamezuje tím jejich účast na biosyntése. Posleze se provádí regulace mechanismem známým jako útlum~o~vý falktor, pod kontrolou útlumové oblasti genu, oblasti, která je uvnitř hlavní trp-sekvence. Viz obecně G. F. Miozzari a spolupracovníci v časopise j. Bacteriology 133,1457 197 ~ 8 monografie The Operon, str. 263 až 302, vydavatele Miller a Reznikoff,Cold Spring Harbor Laboratory 19.78 F. Lee a spolupracovníci, Proc. Natl. Acad. Sci USA 74, 43165 1977 a K. Bertrand a spolupracovníci, j. M-ol. Biol. 103, 319 197 i 6. Zdá se, že stupeň útlumu je ovládán intracelularní koncentrací tryptofanu, a u divokého typu bakterií E. coli Likončuje útlumovvý článek expresi přibližně v devíti z deseti případů, pravdepodobne vytvářením sekundární struktury neboli terminační smyčky v informační RNA, což má za následek, že se RNA-polymeráza předčasně vypmstí z připojení k DNA, jiní pracovníci p-oužili trp operón za účelem, aby ziskali nějaké měřítko pro expresi heterologických peptidů. Tento pracovní směr se polkouší řešit problémy represe a útlumu přidáváním kyseliny indolylakrylové, indukt-oru a analogu, který soutěží s tryptofanem o trp represory v molekule, a směřuje k vyvolání deprese pomocí kompetitivní inhibice. Induktor zmenšuje současně útlurm inhibicí enzymatické konverse indolu na tryptofan a tak tíčinně zbavuje buňky tryptonftanu. Výsledkom je. že více polymeráz úspešne transkribuje přes útlumový článek. Tento přístup se však zdá problematiclçý z hlediska důsledného dokončení translace a provedení ve vysokém výtěžku, nebot syntéza za -bílkovinové sekvence obsahující tryptofan se předběžíiě ukončí v důsledku nedostatku využitelného tryptotantl. Účinné snížení útlumu pri tomto přístupu jest ovšem úplně závislé na silném tryptotánovém hladověuí.vynález se věnuje problemům Spojenými s represí a ütlumem blosyntézy tryptotľauu odlišným způsobem. Předmětem yynálezu je1. způsob získáuvání plasmidiclšých vylučovacích prostředků určených pro prímou expresi heterologiclçých genů z trp promotoru-operátoim2. způsoby získavaní plasmidlckých vylučovacích prostředků určených pro expresi, z tryptvofánového toperátoru-promotoru, specificky štěpitelných polypeptidů kódovaných fúzemi homologiclšých a heterologických genů, a3. způsob výroby heterolo-gických polyppetidů bakterialní expresí, vyznačující se tim, že ho lze provádět kontrolovatelně, účinně a ve vysokých výtěžcích, a způsob výroby potřebných prostředků.Po-dle vynálezu lze přiwpravolvat nové plasmidické vyluwčovací prostředky určené pro bakteriální výrobu lieterologických polypeptiwdíckých produktů, přičemž zmívněné plasmidické prostředky mají sekvenci dvojvläk 238046nov-é DNA zahrnující, ve fäzi od prvéh-o- 5-konce k druhému 3-k 0 nci kódovacího řetězce, trp-promotor-operátor, nukleotidy kódující na ~hlav~ní trp vazebně místo ribozomů a nukleotidy kódující iniciaci translace pro expresi strukturálniho genu, ve kterém je zakôdovaná .aminokyselín-eva sekvence heterologického upolypeptidu. Uvedená DNA sekvence neobsahuje ani trp útlumovou oblast, ani nukleoitiidy kódující na trp E ribozómo-vé vazebné místo. Místo toho je trp hlavní ríbozóniove místo účinné VYUŽÍÍO k t-omu, aby vykonávalo expresi informací zakódovaiíýclí ve Vloženěm genu.BuňJky se transformují pridaním plasmidü pripravených způsobem podle vynálezu .a o-bsahujících trp promotor-woperátor, který-m Ivšak chybí útlutníovwý článek, a kultivují se V prítomnosti záměrně přidaného tryptot-anu. Použití živného prostředí bohatého na tryptofan umožňuje, aby dostatek tryptofanu v podstatě úplně potlačíl inter-akce trp promotor-operatoru s trp-represorem, talkže růst buněk může postupovat bez inhibice předčasnýxm vylučováním velkých množství heterol-ogických polypeptidů zakódovaných ve Vloženém gcnu, jinak pod kontrolou trip promuotorového-operátorového systému. Když se rekombinovaqíá kultura vypěstuje na úroveň vhodnou pro průmyslovou produkci polypeptidu, vnější zdroj tryptowfanu se naopak odstraní a buňlky se nechají odkázány pouze na tryptofan, který mohou samy produk-ovat. Výsledkem je slabé omezení tryptofanu, V důsledku toho je jpotlačena biosyntéza a dojde k vysoce účírnnému vylučování vložené-ho Iheterologickěho genu, nebráněné útlumem, protože útlumová oblast je ze systému výpuštěna. Tímto způsobem nejsou bunky nikdy příliš zbavený atryptoftanu a všechny bílkoviny, at obsahují tryptofan unebo ne, mohou být produkováný ve vysokých uvýtěžcích.Vynález rovněž zahrnuje způsoby dvojvláknove DNA vhodnými prostředky v kterémkoliv žádaném místě, dokonce i v nepřitomunosti restrikčního enzymového rmista uvedená pracovní technilkaa je vhodná, mimo jiné, k sestrojeni trp-operónů majících deletovaný útlumový článek, a to jiným způsobem než byly získáválny dříve sel-ekci mutantů.Předmětem .vynálezu je tedy způsob štěpení vdvojvlákwnové DNA v» kterémkolív daném bodě, jehož podstata spočívá v tom, žea dvojvláknová DNA se převede V .okolí wobklopujícim daný bod na jednovláknovou DNA, b na jednovláknový úsek vytvořený ve stupni a se hybridizuje komplementární délka jednovlákxnového DNA priméru, přičemž 5 konec priméru leží na opačné straně nukleotidu přípojeného k zamýšlenému štěpicímu místu, C obnoví se ta část druhéh-o vlákna eliminovanehto ve stupni a), která leží V 3 směru od uvedeného priméru, reakcí s DNApoymerázou v prítomnosti trifosfátů desoxynnukleotidů obsahujících adenin, thymin,guanin a cytosin ad digeruje se zbývající jednovláknová délka DNA, která vyčnívá za zamýšleným štěpícím místem.Posléze vynález umožňuje výrobu různých užitočných mezíjproduktů a konečných produktů, včetně specificky štěpitelnýoh heterologicky-h-o-mologických fuzovalných bílkoviun, ktere jsou stabilizovány vůči odbourávani za podmínek vylučování.Způsob podle vynálezu, jeho podstata a výhody jsou bliže objasněiíy v následujícím podrobněrm popisu a -na přiložených výkresech na obr. 1 až 13.Obr. 1 a 2 ilustrují výhodne schéma přípravy plasmidů schopných exprese heterologických genü ve formě fúzí s částí trp D polytpeptidü z těcshto fúzovaných bílk-oviun je lze později specificky odštěpít.Obr. 3 znázorňuje výsledek dělení buněčné bílkoviny o~bsahující ho-In-ologické trp D a heterolvogické soinatostatin nebo .thymosin w 1 fúzované bílkoviny, za použití elektroforézy na polyakrylamidovém gelu.Obr. 4, 5. a 6 znázorňují postupné stupně výhodinéhoi schématu pro sestrojení plasmidu schopného prímeho. vylučování heterologického genu lidského růstovétho hormonu-HGH-gen za kontroly trp jpromotorového-operátoroveho systemu.Obr. 7 znázorňuje výsledek dělení buněčné bílkoviny obsahující lidský růst-ový hormon HGH přímo vylučovaný za kontroly trp-promotorověho-operátorového systému, za použití elelktroforézy na p-olyakrylamidovém gelu.Orbr. 8, 9 a až b a 1-0 znázorňují postupné stupně výhodného schématu pro sestrojování plasmidů schopnýcuh vylučování heterolovgických genü ve znazorněném případě somatostatinu ve formě túzi s částí trp E polypeptidu z těchto túzovaných bilkovin lze heterologické peptidy později specifícky odštěpit. Na obr. 9 a a znamená 5-3 digesci komplementárnílío vlákna LE strukturálního genu lambda-exonunkleázou, b znamená připojení oligonukleotidu 26,32 pCCTGTGCATGAT na vzdálenější konec LE kódujícího vlákna a c znamená Klenowovu polymerázu I 5 ~ 3-polymeráza 4 dNTP a 3-5 exonukleáza).Obr. 1 ~ 1 znázorňuje výsledky dělení buněčné bílkoviny obsahující homologické trp E a heterologické fúzované bíllkoviny vhodné pro produkci například soIn-atostatiunu,thymosinu alfa 1, lidského proinsulinu A a B řetězců lidského insulinu, za použití elektroforézy na polyakrylamidovéąm gelu.Obr. 1 × 2 a 13 znázorňují postupně stupně způsobu, při kterém plasmid vytvorený postupem znäzorněným na obr. 8 až 10 včetně je zpracován tak, aby vytvořil systém, ve kterém se mohou zaměnitelně vylučovat jiné heterol-ogickê geny ve formě fúzí s polypeptidickými sekvencemi trp E peptidu.Na uvedených obrázcích jsou z důvodu jasn-osti ilustrace zobrazeny ve většině příjpadů jen kódovací řetězce dvojvláknového plaemldu a lixneárních DNA. Geny kódujíci resistencí vůči rantibiotikům jsou označený apR resistance vůči ampícilinu .a to (re~ sistence vůči tetracylklinul Označení tcs znamená gen pro tetracyklinovou resistancí, který »není pod kontrolou prornot~oroveho~-operátoroveho systému, takže plasmidy obsahující tento gen nemohou být nikdy cit« live na tetíracyklin. Legenda aps značí amąpicilinovou citlivost vznikla-u vynechá~ ním části genu kódující empicilinovou citli Označení Nulkleotidové sekvence endonukleázy a místo štepení J» AGA TCŤT Ec-oRI St TTC CTTAAG 1 J B 2111 A GATC T TC TAGA L 1 PvulI GAG C TG G TCGAC j t BaInHI GGATC C C C TAG G TKdyž jsou body štěpení prostorově umístěny vodděleně na příslušných řetězcích, jsou rozštěpené konce lepivé zachytnéj, tj. schopne opětovííé anelace uzavření kruhu-nebo schopné připojení na jiné komplementärní DNA zako~nčene lepivým koncern, podle Watsonova-Crickova principu párrování wbasí A s T -a G s C na principu »drážky a čepu.Některé restrikční enzymy, jako shore. uvedený Hpal a PvuII štěpí řetězec DNA za vzniku otupenýcsh konců. Sh-ora uvedené nulkleotidove sekvence jsou znäzorněny v souhlase s bežnými konvencemi vrchní řetězec je řetězec kódující bilkoviny a při postupu z leva do prava po zmíněném řetězci jde o pohyb z jeho 5-k~once na Sükonec, tj. ve směru transkripce »od bližšího ke vzdálenějšímu bodu.Posléze v souhlase s konvencemi, symbol A značí deleci vynechání určite seknvence). Tak například označení plasmidu A EcoRI-Xbal popisuje plasmid, ze kt-eré« ho byla vodstraněwna líukleotidická sekvencevost. Plasmídicke promotory a operátory jsou označený p a o. Písmena A, T, G a C -označují nukleotidy obsahující base adenin, thymin, guanin a popřílpadě cytuosin. Význam dalších legend uvedených v obrázcích bude vysvětlen v následujícím textu.Výhodná provedení Způsobu podle vynálezu popsaná níže zahrnují použití řady běžně dostupných ľeStľĺlšČllĺCh endonukleáz identifikovaných v dalším popisu jejich odpovídající rozpoznávací sekvence a vzory štěpení místa štěpeni jsou označena šípkami jsou znázornený nížeOznačení Nukleotidové sekvence endonukleázy a místo štěpeííí W 1 TJČGA AG CT Ak GT CT T Hlndllll TTCGAA T i HP GTTAAC CAA T TG Tmezi rmísty působení restrikčních enzymů EcoRl a XvbaI digescí těmito enzyrny. Pro lepší názomost jsou některé delece »označe na čísly.Talk například, počínaje prvním páreín basí bp nozpoznávacího místa -enzymu EcoRI,který předchází genu pro tetnacyklinvovou resistenci v rodičovskérn plasmidu pBR 32.2,značí A 1 vynechání párů bp 1 až 30 (tj. AEcoRI až HindIII a z toho vyplývající eliminaci tetracyklinového pr-omotorovéhąo ~ operátoroveho systému A 2 značí »deleci bp 1 až 375 tj. AEcoRI až BiaimHl) a z toho vyplývající odstranění jak tetracyklinového provmnotoru A operátoru, tak strukturálniho genu, který kóduje tetracyklinovou resistenci a A 3 značí vynechání sledu bp 3811 až 4359 (tj. APstI až EccRI) a .v důsledku toho elíminaci ampicilinové resís~ tance. symbolu A 4 se používá k označení odstranění sekvence bp~ 900 až ~ 1500 z trp operotn-ovéh-o tragmentu 5 viz obr. 1 a v důsledku toho. velimínaci strukturálního genu puo polypeptld trp D.

MPK / Značky

MPK: C12N 15/00

Značky: štěpení, dvojvláknové, bodě, způsob, daném, kterémkoliv

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/30-238646-zpusob-stepeni-dvojvlaknove-dna-v-kteremkoliv-danem-bode.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Způsob štěpení dvojvláknové DNA v kterémkoliv daném bodě</a>

Podobne patenty