Spôsob čistenia trombínu podobných proteáz z hadích jedov

Číslo patentu: 284874

Dátum: 27.12.2005

Autori: Zahn Wolfgang, Schwarz Margarete

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Opísaný spôsob čistenia trombínu podobných proteáz pozostáva z troch chromatografických krokov. Surový produkt proteázy sa v prvom stupni podrobuje afinitnej chromatografii alebo chromatografii na zásaditom iónomeniči. V ďalšom stupni chromatografii na slabom katexe alebo adsorpcii na sklo v zásaditej oblasti a v poslednom kroku gélovej chromatografii alebo chromatografii na skle v kyslej oblasti.

Text

Pozerať všetko

(22) Dátum podania prihlášky 18. 2. 1997 2006,(24) Dátum nadobudnutia (51) Im C 1 účinkov patentu 5. 1. 2006 Vestník UPV SR č. 112006 CIZN 9/64(31) Číslo priorítnej prihlášky 196 07 210.7 A 511( 33/0(32) Dátum podania priorimej prihlášky 26. 2. 1996 ÚRAD (33) Krajina alebo regionálna PRIEMYSELNÉHO organizácia priority DE VLASTNICTVA (40) Dátum zverejnenia prihlášky ll. 1. 1999 SLOVENSKEJ REPUBLIKY Vestník ÚPV SR č. 01/1999(47) Dátum sprístupnenía patentu verejnosti 27. 12. 2005(62) Číslo pôvodnej prihlášky v prípade vylúčenej prihlášky(86) Číslo podania medzinárodnej prihlášky podľa PCT PCT/EP 97/00755(87) Číslo zverejnenia medzinárodnej prihlášky podľa PCT W 097/320 l 5 4(73) Majiteľ Abbott GmbH Co. KG, Wiesbaden, DE(54) Názov Spôsob čistenia trombinu podobných proteáz z hadích jedovOpísaný spôsob čistenia trombinu podobných proteáz pozostáva z troch chromatograñckých krokov. Surový produkt proteázy sa v prvom stupni podrobuje afinitnej chromatograñí alebo chromatografii na zásaditom ionexí. V ďalšom stupni chromatograñí na slabom katexe alebo adsorpcii na sklo v zásaditej oblasti a v poslednom kroku gélovej chromatogratii alebo chromatograñi na skle v kyslejPredložený vynález sa týka spôsobu čistenia trombínu podobných proteáz z hadich jedov.Prikladmi pre takéto proteázy sú batroxobin, crotalasa a predovšetkým ancrod. Posledne uvedený je antikoagulantom, ktorý sa dá izolovat z jedu hada Agkistrodon rhodostoma (Merck-Index 1989, Nr. 664). Na jeho prípravu z hadieho jedu boli opísané už viaceré spôsoby (GB-PS l 094 301, GB-PS l 177 506, GB-PS l 293 793, US-PS 3 743 722, US-PS 3 879 369, DE-OS 2 428 955, DE-OS 2 734 427). Tieto spôsoby sú založené v podstate na chromatograñckých krokoch a poskytujú ancrod v rozličných výťažkoch a čistotách.Príprava vysokočistého ancrodu z hadieho jedu sa doteraz nepodarila. Izolovala sa vždy zmes enzýmov s ancrodom ako hlavnou zložkou, ktorý bol po príprave viac alebo menej znečistený cudzími proteínmi.Teraz sa našiel spôsob, akým je možné pripraviť trombínu podobné proteázy z hadích jedov vo vysoko čistej forme.Predmetom vynálezu je spôsob čistenia trombínu podobných proteáz z hadích jedov, ktorý pozostáva z toho, že sa a) surový produkt proteázy podrobí predčisteniu pomocou añnitnej chromatograñe alebo chromatografie na zásaditom ionexi, b) takto získaná frakcia s trombínu podobnými enzýmami sa podrobi chromatografii na slabom katexe alebo sa oddeľuje adsorpciou na skle v zásaditej oblasti ac) hlavná zložka z kroku b) sa podrobí gélovej chromatograñi alebo sa prečistí chromatografiou na skle v kyslej oblasti, pričom však najmenej jeden z krokov b) a c) obsahuje oddelenie pomocou adsorpcie prípadne chromatografie na skle.Odporúča sa uskutočňovať v stupni b) čistenie adsorpciou na skle a v stupni C) čistenie pomocou gélovej chromatografie.Predovšetkým výhodným uskutočnenim vynálezu bude nielen v stupni b) alebo tiež v stupni c) čistenie pomocou adsorpcie prípadne chromatografie na skle.Na predčistenie pomocou añnitnej chromatografie sú vhodné predovšetkým agmatin-, arginín alebo heparinSepharose.Ako zásadité ionexy sú na čistenie vhodné DEAE-celulóza a DEAE-Sepharose.Ako tlmivé roztoky pre ionexovú chromatografiu sa uvádzajú predovšetkým trisfosfátový a nátriumfosfátový pufer.lonexová chromatografie sa uskutočňuje pri hodnote pH 5 až 9, výhodne 6 až 8,5.Pri predčistení sa zo surového enzýmu odstráni asi 70 až 80 cudzích proteínov a iných podielov.Ak sa druhý krok čistenia uskutočňuje s katiónovým ionexom, potom prichádzajú do úvahy nasledujúce slabo kysle ionexy CM-SEPHAROSE, pH hodnota 5 až 9 a AMBERLITE CG 50, pH hodnota 5 až 9.Chromatografia na skle znamená, že ancrod a príbuzné trombínu podobné enzýmy, ako aj zásadité proteázy pri hodnotách pH 7,5 až 9,0, výhodne 8,0 až 8,5 budú viazané na sklenenú matricu. Približne 60 predovšetkým kyslých cudzích proteínov bude ako neviazane sa vymyje z kolóny pomocou tlmivého roztoku (výhodne trisfosfátový a nátriumfosfátový pufer). Ancrod sa eluuje v čistote viac ako 90 vo fonne frakcií, pričom iónová sila pufra sa pridaním kuchynskej soli zvýši na 0,3 až 1,0 M.V druhom kroku čistenia sa enzým obohatí na približne 90 .Pri gélovej chromatografii ako kroku čistenia c) prichádzajú do úvahy predovšetkým SEPHACRYL S-l 00 HR,SUPERDEX, SEPHADEX, ULTROGEL a SUPEROSE.Ak sa pri tomto kroku čistenia c) zvolí Chromatografia na skle, potom sa v kyslej pH oblastí 4 až 6 adsorbujú zásadité cudzie proteíny z roztoku ancrodu na povrchu skla,zatial čo ancrod sa s čistotou viac ako 95 eluuje z kolóny priamo do pufra. Požadovaná iónová sila pufra sa môže regulovať pridaním soli, ako je kuchynská soľ.Nový spôsob je vhodný predovšetkým na získanie čistého ancrodu, ktorý sa pri tomto spôsobe čistenia získa v čistote jednoznačne vyššej ako 95 .3 g sušeného jedu malajskej zmije banskej (Grubenotter) sa rozpustilo V 50 ml ttis(hydroxymetyl)aminometánového (TRIS)-fosfátového pufra s hodnotou pH 8,5,nerozpustne bunkové podiely jedu sa odcentrifúgovali a čiry žltý roztok sa naniesol na chromatografickú kolónu s priemerom 1,6 cm, ktorá bola naplnená do výšky 30 cm DEAE-SEPHAROSE-FF (Firma Pharmacia). Trombínu podobné enzýmy jedu, ako aj protein s kyslým charakterom sa naviazali na matricu. Chromatografia sa uskutočňovala s priememou rýchlosťou prietoku 150 až 200 ml/h. Premytím kolóny pri Iaboratómej teplote s približne 300 ml pufra(10 mM TRIS-fosfátový pufer s pH 8,5 až pokým hodnota Ammm eluátu poklesla na 0,5 a ďalším premývanim 400 ml 35 mM TRIS-fosfâtového pufra pH 6,0 až do hodnoty eluátu A 280, 0,4 sa eluovalo asi 70 až 80 cudzích proteínov (vztiahnuté na optickú hustotu východiskového roztoku pri 280 nm). Hlavná frakcia s obsahom ancrodu sa eluovala s výťažkom 85 v l 50 až 200 ml l 50 mM TRIS-fosfátového pufra pH 6,0.Eluát, ktorý obsahoval ancrod sa zahustil pomocou ultrañltrácie na membráne s mennýrn limitom oddeľovania 10000 Daltonov na 20 ml a nastavil sa l 00 mM TRIS-fosfátového pufra na pH 8,0. Tento roztok sa naniesol na kolónu s priemerom 1,6 cm, ktorá bola do výšky l 5 cm naplnená BlORAN-CPG sklom (Firma Schott, priemer pórov 25 až 35 mm, veľkost zŕn 30 až 60 m). Premytím na kolóne pri Iaboratómej teplote s 300 ml 100 mM TRIS-fosfátového pufra pH 8,0 a pri priememej rýchlosti prietoku 250 ml za hodinu sa eluovalo približne 60 cudzích proteínov (vztiahnuté na optickú hustotu naneseného roztoku pri 280 nm).Na eluovanie sa použil 0,5 M roztok chloridu sodného,ktorý sa pridaním 100 mM TRlS-fosfátového pufra upravil na hodnotu pH 8,0. Eluát sa automaticky zachytáva V asi lO ml frakciách. Trombínu podobne enzýmy sa eluovali v píku s následnou oblasťou tvorby chvosta. Aby sa hlavnázložka (zodpovedajúca ancrodu) získala vo forme, ktorá obsahuje nanajvýš 5 trombínu podobných vedľajších zložiek, sledovali sa pri prechode hlavného píku k oblasti chvosta jednotlive frakcie ihned z hľadiska ich špecifické aktivity fibrinogenázy, ako aj z hľadiska ich celkového zloženia pomocou HPLC s obrátenými fázami. S hlavným píkom sa spojili len frakcie, ktoré mali špecifickú aktivitu vyššiu ako 1700 U/oDgggnm a ktoré vykazovali pri HPLC menej ako 10 vedľajších zložiek (asi 80 ml). Hlavná zložka sa získala v čistote 96 a vo výťažku 72 z kolóny BIORAN.Eluát s hlavnou zložkou ancrodu sa pomocou ultratiltrácie na YM l 0 membráne (firma Amicon) zahustil na objem 2 ml a získaný koncentrát sa naniesol na kolónu s priemerom 1,6 cm, ktorá bola do výšky 85 cm naplnená SEPHARYL-om S-100 HR. Najskôr sa nastavila rovnováha na kolóne pomocou pufra s obsahom 100 mM chloridu sodného a 100 mM fosforečnanu sodného, ktorý mal hodnotu pH 6,9. Gélovou chromatografiou sa zvyšné proteázy,ako aj TRlS oddelilí od ancrodu. výťažok predstavoval pri tomto kroku približne 90 .2,1 g sušeného jedu malajskej zmije banskej (Grubenotter) sa rozpustilo v 50 ml 35 mM (TRIS)-fosfátového pufra s hodnotou pH 8,5, nerozpustnć bunkové podiely jedu sa odcentrifúgovali a číry žltý roztok sa naniesol na chromatografickú kolónu s priemerom 1,6 cm, ktorá bola naplnená do výšky 30 cm DEAE-SEPHAROSE-FF (Finna Pharmacia) a rovnováha nastavená pomocou uvedeného pufra. Premývaním kolóny pri laboratómej teplote so 600 ml pufra až po hodnotu Azgomm eluátu 0,2 sa eluovalo asi 70 cudzích proteínov (vztiahnuté na optickú hustotu východiskového roztoku pri 280 nm). Hlavná frakcia sa eluovala vo výťažku 90 až 100 s 200 až 250 m 1 150 mM TRIS-fosfátového pufra s pH 6,0.Eluát sa zahustil ako v príklade 1 na 20 ml a rovnováha sa nastavila s 50 mM Na-fosfátového pufra na hodnotu pH 8,5. Tento roztok sa naniesol na sklenenú kolónu BIORAN-CPG (priemer 1,6 cm, výška 15 cm, priemer pórov 25 až 35 mm, veľkosť zŕn 30 až 60 m). Premývaním kolóny pri laboratómej teplote s 300 ml 50 mM Na-fosfátového pufra pH 8,5 a pri priememej rýchlosti prietoku 250 ml za hodinu sa z kolóny eluovalo približne 60 cudzích proteínov(vztiahnuté na optickú hustotu naneseného roztoku pri 280 nm).Na eluovanie trombínu podobných enzýmov sa použil l M roztok chloridu sodného, ktorý sa pridaním 50 mM Na-fosfátového pufra nastavil na hodnotu pH 8,0. So 150 ml pufra sa eluovalo približne 80 nanesených jednotiek enzýmu.Eluát sa zahustil na objem 20 m 1, ako je opísané a nastavil s 50 mM Na-fosfátu pufra, ktorý vykazoval hodnotu pH 5,0. Tento roztok sa naniesol na kolónu s rovnakým priemerom 1,6 cm, ktorá bola do výšky 15 cm naplnená BIORAN-CPG-sklom, s priemerom pórov 90 až 100 nm a veľkosťou zŕn 30 až 60 m. Pri pH 5,0 sa viazali len zásadité proteíny, zatial čo hlavná zložka Ancrod sa z kolóny eluovala pomocou pufra, v čistote približne 100 a vo výťažku asi 80 až 90 (vztiahnuté na nanesené jednotky).2,1 g sušeného jedu malajskej zrnije banskej (Grubenotter) sa analogicky, ako je opísané v príklade 2, predfrakcionovalona DEAE-SEPHAROSE, eluát sa analogicky ako v príklade l zahustil na 20 ml a nastavil so 40 mM TRISfosfátového pufra s pH 6,2. Tento roztok sa naniesol na chromatografickú kolónu s priemerom 1,6 cm, ktora bola naplnená do výšky 20 cm s CM-SEPHAROSE-FF (Firma Pharmacia) a ekvilibrovaná uvedeným pufrom. Premývaním kolóny pri laboratómej teplote s 300 ml pufra a pri priememej rýchlosti prietoku 250 ml za hodinu sa eluovalo približne 60 cudzích proteínov (vztiahnuté na optickú hustotu naneseného roztoku pri 280 nm).Na eluovanie trombínu podobných enzýmov sa analogicky ako v príklade 2 použil 1 M roztok chloridu sodného,ktorý sa pridaním 50 mM Nafosfátového pufra nastavil na hodnotu pH 8,0. So 150 ml pufra sa eluovalo približne 80 nanesených jednotiek trombínu podobných enzýmov.Dočistenie ancrodu sa uskutočnilo analogicky ako v príklade 2 na BIORAN-CPG skle (priemer pórov približne 100 nm, veľkost zŕn 30 až 60 m). Ancrod sa z kolóny eluoval v čistote vyššej ako 95 a s výťažkom približne 85 (vztiahnuté na naneseně jednotky).1. Spôsob čistenia trombínu podobných proteáz z hadíchjedomvyznačuj ú ci sa tým,žesa a) surový produt proteázy podrobí predčisteniu pomocou afinitnej chromatograñe alebo chromatograñe na zásaditom ionexí,b) takto získaná frakcia s trombínu podobnými enzýmami sa podrobí chromatograñi na slabom katexe alebo sa oddeľuje adsorpciou na skle v zásaditej oblasti a c) hlavná zložka z kroku b) sa podrobí gélovej chromatografu alebo sa prečistí chromatografiou na skle v kyslej oblasti,pričom však najmenej jeden z krokov b) a c) zahrnuje oddelenie pomocou adsorpcie prípadne chromatografie na skle.2. Spôsob podľa nároku l, v y z n a č uj ú c i s a t ý m , že čistenie pomocou adsorpcie v stupni b sa uskutočňuje na skle a stupeň c) sa uskutočňuje pomocou gélovej chromatografie.3.Spôsob podľanároku Lvyznačuj úci sa t ý m , že čistenie v stupňoch b) a c) sa uskutočňuje pomocou chromatografie na skle.

MPK / Značky

MPK: C12N 9/64, A61K 38/00

Značky: čistenia, spôsob, jedov, podobných, proteáz, hadích, trombínu

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/3-284874-sposob-cistenia-trombinu-podobnych-proteaz-z-hadich-jedov.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob čistenia trombínu podobných proteáz z hadích jedov</a>

Podobne patenty