Spôsob výroby roztokov imunoglobulínov s inaktivovanými vírusmi

Číslo patentu: 280680

Dátum: 12.01.1995

Autori: Gehringer Werner, Selosse Patrick

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Spôsob výroby roztokov imunoglobulínov s inaktivovanými vírusmi, vhodných na intravenóznu aplikáciu, pri ktorom sa na imunoglobulín pôsobí vo vodnom roztoku tenzidmi, ktoré sa potom odstránia extrakciou na pevnej fáze na hydrofilných materiáloch, pričom po spracovaní neiónovými tenzidmi sa roztok extrahuje biologicky kompatibilnými rastlinnými olejmi a potom sa tieto oleje oddelia.

Text

Pozerať všetko

PRIEMYSELNÉHO VLASTNÍCTVA SLOVENSKEJ REPUBLIKYČíslo priorítnej prihlášky P 41 25 525.5 5 l) Int C 171Krajina priority DE C 07 K 1/20Dátum zverejnenia udelenia vo Vestníku 12.06.2000(73) Majiteľ patentu Octapharma AG, Lachen, CH(72) Pôvodca vynálezu Gehringer Wemer, Wien, AT Selosse Patrick, Bordeaux, FR(54) Názov vynálezu Spôsob výroby roztokov imunoglobulínov s inaktivovanými vírusmiSpôsob výroby roztokov imunoglobulínov s inaktivovanými vírusmi, vhodných na intravenóznu aplikáciu,pri ktorom sa na imunoglobuiin pôsobí vo vodnom roztoku tenzidmi, ktoré sa potom odstránia extrakciou na pevnej fáze na hydrofilných materiáloch, pričom po spracovaní neiónovými tenzidmi sa roztok extrahuje biologicky kompatibilnými rastlinnými olejmi a potomsa tieto oleje oddelia.Vynáíez sa týka spôsobu výroby roztokov imunoglobulínu s inaktivovanými vírusmi, ktore sú vhodne na výrobu intravenóznych injekeií.Imunoglobuliny sú humorálne glykoproteíny, ktoré pri elektroforćze plazmovej alebo serovej bielkoviny cestujú V tzv. gama-frakcii, a preto boli v minulosti označované termínom gamma-globulíny.lmunoglobulíny sa vďaka svojmu vysokému obsahu protilátok používajú pri profylaxií a terapii infekcií.le známa výroba imunoglobulínov tak na intramuskulárnu, ako aj subkutánnu aplikáciu. Často používanou výrobnou metódou je tzv. Cohn-Oncleyova frakcionácia, ktorá býva tiež označovaná názvom 6/9-metóda. (Cohn a ďalší, l. Am. Chem. Soc. 68, 459 (946) Oncley a ďalší, J. Am. Chem. Soc 71, 541 (1949.Tento výrobný postup má však nevýhodu v tom, že vedie ku vzniku vysoko viskózneho roztoku, ktorý je aplikovateľný len intramuskuláme alebo subkutánne a ktorý obsahuje vysokú koncentráciu protilátok v relatívne nízkom objeme. Získaný produkt je síce pri teplote 4 C stály, pôsobením plazmlnových nečistôt však môže dochádzať k proteolýze. Ďalej v ňom môžu byť prítomné lgA- a IgG-diméry, ktoré pri aplikácii môžu viesť u pacientov k anafylaktickej reakcii (Ullmann, Encyclopedia of Industrial Chemistry. 1989, A 14, strana 93, 94).Z tohto dôvodu boli vyvinuté íntravenôzne aplikovateľne imunoglobulíny, ktorých znášanlivosť pacientmi je zlepšená. Tieto produkty sa vyrábajú z tzv. frakcie 3 alebo tiež Cohnovej frakcie 2 (pozri uvedená citácia Cohn a ďalší) pri pH 4 pri použití polyetylénglykolu, nasledujúceho zrážania etanolom, ultra- alebo diafiltrácie a ionexovej chromatograñe. Týmto spôsobom získaný imunoglobuíín sa stabílizuje mono- a disacharidmi.Takýto zlepšený postup je opísaný v európskej patentovcj prihláške EP 0 073 371.Pôvodná frakcía 3 (pozri uvedená citácia Cohn a ďalší) sa po rozpustení a nastavení hodnoty pH na 4 podrobí ultrafiltrácii a diafiltrácii. Potom sa získaný ñltrát skoncentruje na obsah bielkovín 5 hmotnostných a obsah alkoholu sa zníži na 8 hmotnostných. Po skoncentrovaní získaného roztoku imunoglobuíínu na obsah bielkovín 8 sa získa čiry vode podobný roztok s iónovou silou 0,0 l a hodnotou pH 4,2. Tonicita roztoku sa nastaví 10 roztokom maltózy pri obsahu bielkovín 5 hmotnostných. Potom sa vzniknutý roztok sterilizuje íiltráciou a lyotilizuje. Lyofilizovaná látka sa pred injekčným použitím rozpustí vo vhodných médiách.Veľkou nevýhodou takto získaných imunoglobulínov na intravenóznu aplikáciu jc, žc sa pred použitím musia najprv rozpustiť vo vhodných médiách aje možne ich skladovať len v lyoñlizovanej forme.Dalšou nevýhodou je, že pri použití týchto imunoglobulínov je možné na pacientov preniest vírusy, pretože pri výrobnom postupe nedochádza k žiadnej inaktivácii virusov. Existujú správy, že pri intravenóznom podaní imunoglobullnov došlo k ochoreniu hepatitis a HIV (Ullmanns Encycl. of 1 nd. Chem., zv. A 14, 1989, strana 102, 103).V EP-A 1-366946 je opísané odstraňovanie neiónových detergentov použitých pri inaktivácíi vírusov z biologicky aktívnych tekutín, ako je imunoglobulin. Fri tom sa používa hydrofóbna ínterakčná Chromatografia.V EP-A 2-239859 je opísane odstraňovanie detergentov inaktivujúcich vírusy z biologických tekutín, ako je imunoglobulín, pomocou extrakcie olejmi.Úlohou tohto vynálezu preto bolo vyvinúť spôsob inaktivácie vírusov v intravenózne vstrekovateľných imunoglobulínoch, ktorý by viedol k vzniku produktu, pri použití ktorého by nemohlo dôjsť k žiadnemu prenosu vírusov na pacienta a ktorý by bol taký stály, že by ho bolo možné vyrábať priamo vo forme injekčnćho roztoku bez lyofilizácie a v tejto forme by ho bolo tiež možné skladovať.Táto úloha bola vyriešená spôsobom podľa vynálezu. Predmetom vynálezu je spôsob výroby roztoku imunoglobulínu s inaktivovanými vírusmi, vhodného na intravenóznu aplikáciu, pri ktorom sa na imunoglobulín pôsobí vo vodnom roztoku tenzidmí, ktoré sa potom odstránia extrakciou na pevnej fáze na hydrofilných materiáloch, ktorého podstata spočíva v tom, že sa roztok po spracovaní neiónovými tenzidmí extrahuje biologicky kompatibilnými rastlinnými olejmi a potom sa tieto oleje oddelia.Ako neiónovć tenzidy sa používajú najmä TNBP (tri-n-butylfosfát) a/alebo Triton X 100. Hodnota pH roztoku je prednostne 5,0 až 5,5.Ako rastlinné oleje sa prednostne používajú ricínový olej alebo sójový olej.Nadväzujúca extrakcia na pevnej fáze sa prednostne uskutočňuje s použítím oktadecylderivatizovanýeh látok,ktoré sa tiež používajú na chromatograíiu s obrátenými fázami. Pri obzvlášť výhodnom vyhotovení sa extrakcia na pevnej fáze uskutočňuje chromatografiou s obrátenými fázami na oktadecylovanej živici (C-18).K hotovému produktu sa po extrakcií na pevnej fáze pridá disacharid kvôli stabilízácii. Hotový roztok sa potom raz alebo viackrát sterilizuje íiltráciou.Pred inaktiváciou vírusu a/alebo po sterilizácii filtráciou sa ďalej môže uskutočniť ultrafiltràcia a diafiítrácia imunoglobulínového roztoku.Nasleduje podrobný opis vyhotovenia podľa vynálezu. Najprv sa, spôsobom známym z doterajšieho stavu techniky, rozpustí tzv. Cohnova frakcia ll vo vode tak, aby vznikol úplne číry roztok. Hodnota pH tohto roztoku sa potom nastaví na 4,0 až 5,0, prednostne 4,5 a roztok sa prefiltruje,aby sa odstránili nečistoty.Potom sa roztok podrobí ultrafiltràcii a skoncentruje sa. Vylučovacia medza molekulovej hmotnosti pri ultrañltrácii je 30 000 daltonov. V tomto stupni sa odstránia najmä nečistoty s niüou molekulovou hmotnosťou. V nadväznosti na ultrafiltráciu sa uskutoční diafiltrácia na odstránenie iónov a na tento stupeň nadväzuje vlastná inaktivácia vírusov.Inaktivácia sa uskutočňuje tak, že sa roztok najskôr ochladí na 4 až 8 °C a hodnota pH sa nastaví na 5,0 až 5,5,prednostne 5,3. Potom sa k roztoku pridajú neiónovć tenzidy, prednostne TNBP a/alebo Triton X 100 a získaný roztok sa niekoľko hodín mieša. V nadväznosti na toto spracovanie nasleduje extrakcia rastlinnými olejmi. Pri tom sa k roztoku pridá 5 hmotnostných rastlinného oleja a roztok sa pri teplote miestností premieša s rastlinným olejom. Po oddelení fáz nasleduje filtrácia.Potom sa roztok nanesie na stlpec C 18 a uskutoční sa Chromatografia. Po chromatografii sa pH roztoku upraví na 4,0 a na úpravu tonusu sa použije maltóza. Po nasledujúcej sterilizácii tiltráciou sa získaný roztok skúša na stabilitu tým. že sa uchováva aspoň 22 hodin pri 37 °C. Ak dôjde kzakaleniu roztoku, je roztok nepoužiteľný. Ak nedôjde za tento čas k vzniku žiadneho zákalu, nastaví sa hodnota pH roztoku na 5,0 až 5,5, prednostne 5,3, roztok sa podrobí ďalšej ultrafiltrácii a diatiltrácii a pri takto získanom roztoku sa po prídavku maltózy nastaví obsah proteínu 50 g/l. Potom sa ešte uskutoční ďalšia sterilizácia a získaný roztok sa priamo plní do infúznych fliaš.Takto získaný produkt sa môže priamo íntravenózne vstrekovať a neobsahuje žiadne vírusy.Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcom príklade uskutočnenia. Tento príklad má výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu ním nie je v žiadnom ohľade obmedzený.Cohnova frakcia II sa rozpustí v ó-násobnom nmožstve vody a zmes sa mieša tak dlho, pokiaľ nevmikne číry roztok. Potom sa hodnota pH roztoku nastaví 0,5 N kyselinou chlorovodíkovou na 4,5. Nasleduje najskôr ultratiltrácia. pri ktorej sa roztok skoncentruje na 90 g/l. Použije sa typ membrány Novasette 30 K. Potom sa roztok zriedi päťnásobným množstvom vody a podrobí sa diafiltrácii za tlaku 0,03 až 0,05 MPa. Po tejto diafiltrácii je obsah bielkoviny v diafiltrovanom roztoku nastavený na 70 g/l. Roztok sa ochladí na 4 až 8 °C a jeho hodnota pH sa 0,1 N roztokom hydroxidu sodnćho nastaví na 5,3. Potom sa k roztoku pridá 0,3 hmotnostného TNBP a l hmotnostné Tritonu X 100 a zmes sa podrobí intenzívnemu miešaniu. Po asi 4 hodinách pri 4 až 8 °C sa pridá 5 hmotnostných ricínového oleja. Extrakcia olejom sa robí pri 15 °C. Vzniknutć fázy sa oddelia a roztok sa prefíltruje, cez filter s vrstvami Cuno. Potom sa roztok nanesie na stlpec C 18, na ktorom sú zakotvené oktadecylderivatizované látky. Ďalej sa hodnota pH roztoku nastaví na 4,0 a pridá sa 100 g/l maltózy. Potom nasleduje sterilizácia filtraciou a íiltráciou Sterilizovaný roztok sa uchováva 22 až 24 hodín pri teplote 37 °C. Získaný číry roztok sa upraví na hodnotu pH 5,3 prídavkom 0,1 N roztoku hydroxidu sodneho. Znova sa urobí ultraíiltrácia a díafiltrácia, pridá sa maltóza (100 g/l) a obsah bielkovín v roztoku sa nastaví na 50 g/l. Po nasledujúcej filtračnej sterilizácii sa roztok naplní do 50 ml infúznych fliaš, ktoré sú Sterilizovaná a silikonizované, fľaše sa vybavia uzávermi a uzávery sa obrúbia.l. Spôsob výroby roztokov imunoglobulínov s inaktivovanými vírusmi, vhodných na intravenóznu aplikáciu, pri ktorom sa na imunoglobulín pôsobí vo vodnom roztoku tenzidmi, ktoré sa potom odstránia extrakeiou na pevnej faze na hydrofilných materiáloch, v y z n a č u j ú c i s a tý m , že sa roztok po spracovaní neiónovými tenzidmi extrahuje biologicky kompatibilnými rastlinnými olejmi a potom sa tieto oleje oddelia.2. Spôsobpodľanároku l,vyzn ačuj úci sa t ý m , že hodnota pH roztokuje 5,0 až 5,5.3. Spôsob podľa nároku l, v y z n a č uj ú ci s a t ý m , že sa ako neíónový tenzid použije TNBP (tri-n-Butylfosfát) a/alebo Triton X 100.4. Spôsob podľa nárokov 1 až 3, v y z n a č u j ú ci s a t ý m , že sa ako rastlinný olej použije ricínový olej a/alebo sójový olej.5. Spôsob podľa niektorého z nárokov l až 4, v y značujúci sa tým, že saextrakcianapevnej fáze uskutočňuje s oktadecylderivatizovanými látkami, ktoré sa tiež používajú na chromatografiu s obrátenými fázam 1.6. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 5, v y značujúci sa tým, že saextrakcianapevnej fáze uskutočňuje použítím ehromatografie s obrátenýmí fázami na stĺpci C 18.7. Spôsob podľa niektorého z nárokov l až 6, v y značujúci sa týmjesakroztokupoextrakcii na pevnej fáze pridá dísacharid.S. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 7, v y značujúci sa tým,žesahotovýroztokrazalebo niekoľkokrát sterilizuje tiltrácíou.9. Spôsob podľa niektorého z nárokov 1 až 8, v y z n a č u j ú c i s a tý m , že sa roztok imunoglobulínu pred inaktiváciou vírusov a/alebo po sterilizáeii filtráciou podrobí ultrafiltrácii a diatiltrácii.10. Spôsob podľa niektorého z nárokov l až 9, v y značujúcí sa tým,že sapoextrakciínapevnej fáze alebo po pridaní disacharidu vyrobený roztok skúša na stabilitu.

MPK / Značky

MPK: A61L 2/00, A61K 39/395, C07K 1/20

Značky: výroby, spôsob, roztokov, vírusmi, imunoglobulínov, inaktivovanými

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/3-280680-sposob-vyroby-roztokov-imunoglobulinov-s-inaktivovanymi-virusmi.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob výroby roztokov imunoglobulínov s inaktivovanými vírusmi</a>

Podobne patenty