Spôsob výroby trombínu zabezpečeného proti vírusom

Číslo patentu: 279193

Dátum: 08.07.1998

Autori: Eibl Johann, Linnau Yendra

Stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Trombín ľudského alebo zvieracieho pôvodu, ktorý je zbavený infekčných látok, sa pripraví tak, že sa aktivovaný protrombínový komplex, získateľný z plazmovej frakcie obsahujúcej protrombínový komplex, spracuje na inaktiváciu infekčných látok a k spracovanému aktivovanému protrombínovému komplexu sa pridajú soli aktívne pri zrážaní.

Text

Pozerať všetko

I (l l) Číslo dokumentu SLOVENSKA REPUBLIKA I(19) SK 1 Číslo prihlášky 3309-92 Dátum podania 04.11.92 (13) Druh d°km° B Číslo prioritnej prihlášky A 2183/91 (51) 1- C 6 Dátum priority 04.1 1.91 C 12 N 9/74 A 6 lK 38/48 Krajina priority AT ÚRAD Dátum zverejnenia 08.07.98 PRIEMYSELNÉHO VLASTNÍCTVA Dátum zverejnenia udelenia vo Vestniku 08.07.98 SLOVENSKEJ REPUBLIKY Číslo PCT(73) Majiteľ patentu lmmuno Aktiengesellschañ, Wien, AT(72) Pôvodca vynálezu Eibl Johann, Dr., Wien, AT Linnau Yendra, Dr., Wien, AT(54) Názov vynálezu Spôsob výroby trombínu zabezpečeného proti vírusomTrombín ľudského alebo zvieracieho pôvodu, ktorý je zbavený infekčných látok, sa pripraví tak, že sa aktivovaný protrombínový komplex, získateľný z plazmovej frakcie obsahujúcej protrombínový komplex, spracuje na inaktiváciu infckčných látok a k spracovanćmu aktívovanému protrombínovému komplexu sa prídajú soli aktívne pri zrážaní.Vynález sa týka spôsobu výroby trombínu ľudského alebo zvieracieho pôvodu, zabezpečeného proti vírusom.Pri zrážaní krvi prebieha rad po sebe nasledujúcich reakcií, pri ktorých sú aktívovane faktory zrážania krvi a nakoniec sa účinkom aktivovaného protrombínu (trombínu) na fibrinogén tvorí fibrín. Reakcia protrombínu na trombín prebieha samotná s faktorom Xa a vápnikom veľmi pomaly. Táto reakcia prebieha optimálne až potom, kedy je k dispozícii opäť komplex niekoľkých faktorov (protrombinázový komplex). l( tomuto komplexu okrem faktora Xa patrí faktor V, fosfolipidy a vápnik. Faktor Xa štiepi molekulu protrombínu (molekulová hmotnosť 68 kD) proteolyticky, a tým vytvára aktívny enzým trombín (molekulová hmotnosť 30 kD).Plazmové proteáza trombín je viacfunkčný enzým, ktorý nie je koagulovaný iba štíepením ñbrinogénu na fibrín,ale tiež aktivovaný zrážacími faktormi V, VIII a XIlI a štiepený svojím vlastným proenzýmom (protrombínom).V terapii je trombín sám alebo spoločne s ñbrinogénmi používaný na zastavenie krvácania alebo v chirurgii na spájanie tkanív lepiacou technikou.Aktivácia protrombínu cez protrombinázový komplex je ex situ ťažko napodobíteľná, a preto nechýbali pokusy pripraviť trombín pôsobením proteázy ľudského alebo zvieracieho pôvodu. Pritom je známe, že sa má vyhnúť každému kontaktu produktu s materiálom ľudského alebo zvieracieho pôvodu, aby sa zmenšilo nebezpečenstvo kontaminácie látkou spôsobujúcou infekciu.Pokusy spracovať protrombínové komplexy izolované z plazmy s vápenatými iónmí, rovnako ako s vápenatými iónmi a suspenziou obsahujúcou hovädzí tromboplastín ukazujú, že spracovanie so samotnými vápenatými iónmi vedie k podstatnému zníženiu výťažku a čistoty vzniknutého trombínu, ako pri spracovaní s vápenatými iónmi a tromboplastínom (Cryobiology, 21, 661 - 663 (1984.Z DE-A 38 43 126 je známe, že z plazmy, ktorá je adsorbovaná na základnej hmote a spracovaná s protrombínovým aktivátorom, sa môže dostať trombín. Ako aktivátor sa môžu napnklad uviesť vápenaté ióny, vápenaté ióny a tromboplastín alebo faktor Xa Počas aktivácie sú prítomné všetky biologické kofalçtory, ktore sú rovnako viazané na základnú hmotu.Pri použití plazmatickćho protrombínu na získanie trombínu vzniká nebezpečenstvo kontaminácie infekčnými látkami (napríklad vírusom hepatitídy alebo HIV). Okrem toho dochádza ešte k tomu, že pri všeobecne známom spôsobe aktivácie je okrem iónu dvojmocného vápnika odporučené dodatočné použitie biologických kofaktorov, čím sú dané ďalšie zdroje kontaminácíe.Teraz je síce známe, že infekčné látky v biologických preparátoch sa môžu spoľahlivo inaktivovať pôsobením tepla, najmä v kombinácii s ošetrením parou (AT-B 385 657). Pritom sa však ukázalo, že sa trombín na základe svojej tepelnej nestálosti musí zahrievať v prítomnosti stabilizátorov (DE-A 38 09 991), aby sa aktivita trombínu nepoškodila. Použitie stabilizátorov je však sporné, pretože sa počas pôsobenia tepla ochráni nielen aktivita trombínu, ale sa tiež stabilizujú vírusy.Úlohou vynálezu je poskytnúť trombín, ktorý je bezpečný proti vírusom.Trombín bezpečný proti vírusom sa dá získať z vírusovej inaktivovanej plazmovej frakcie, obsahujúcej protrombín, výhradne aktiváciou soľami aktívnymi pri zrážaní, napríklad vapenatými, strontnatými alebo zinočnatými iónmi. Takéto soli podporujú tvorbu trombínu zo zodpovedajúcich zrážacích faktorov. Vynález spočíva na poznatku, že infikujúce látky, ktoré sú prítomné v plazmatickom protrombíne, sa môžu stať neškodné spracovaním protrombínu na inaktivácíu vírusov,bez toho, aby sa biologická aktivita trombínu získaného z protrombínu podstatne ovplyvnila. S prekvapením sa zistilo, že aktivácia samotnej vírusovej inaktivovanej frakcie, obsahujúcej protrombín, prídavok solí aktívnych pri zrážaní, vedie jednoduchým spôsobom k vyššiemu výťažku alebo čistote produktu, bez ďalšieho prídavku biologíckého kofaktora, ako sú zrážacie faktory V, Xa alebo fosfolipidy. Kontaminácia počas aktivácie sa teda zmenší, lebo je tiež pripravovaný trombín, rovnako ako východiskový materiál, zabezpečený proti vírusom. Ako výhodne sa ukázalo pripravovať trombín zabezpečený proti vírusom z vírusovo inaktivovaného protrombínového komplexu, obzvlášť z vírusovo inaktivovaného aktivovaného protrombínového komplexu. Aktivácia aktivovaného protrombínového komplexu prebieha prídavkom solí aktívnych pri zrážaní prekvapujúco vyššou reakčnou rýchlosťou. Výťažok trombínu sa rovnako optimalizuje. Obzvlášť výhodná je výroba trombínu zabezpečeného proti vírusom z Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity, označovanćho v nasledujúcom všeobecne používanou skratkou FEIBA. Aktivovaný protrombínový komplex alebo FEIBA sa môžu pripraviť pomocou už známych opatrení (AT-B 350 726, AT-B 368 883 a EP-B 0 041 173) z protrombínového komplexu. Predmetom predloženého vynálezu teda je spôsob výroby trombínu zabezpečeného proti vírusom, ktorý spočíva V tom, že sa kombínujú opatrenia, totiž že- sa pripraví aktivovaný protrombinový komplex z plazmovej frakcie, obsahujúcej protrombín,- aktivovaný protrombínový komplex sa spracuje na inaktiváciu infekčných látok a- k spracovaněmu aktivovanému protrombínovému komplexu sa pridajú soli aktivujúoe zrážanie, aby sa pripravil trombín.Trombín sa výhodne ďalej čistí iónomeničovou chromatograíiou a/alebo afinitnou chromatogratiou.Trombín zabezpečený proti vírusom podľa uvedeného opisu sa hodí najmä na použitie vo farmaceutických prípravkoch a na výrobu diagnostík. Príklady uskutočnenia vynálezuUvedené príklady ešte bližšie objasňujú vynález pri čom príklady 3 a 4 sa týkajú ďalšieho čistenia trombínu pripraveného podľa príkladu l.l 5 litrov ľudskej krvnej plazmy, ochudobnenej o zrazeninu odstránenú lcryoskopickým technickým postupom, sa uvedie do styku s protrombínom (faktor II) a olcrem toho znižacími faktorrni VII, IX a X na iónomeničovej živici (DEAESephadex). Po eluovaní frakcií obsahujúcich faktor II pomocou 0,5 - molárneho roztoku chloridu sodného sa zníži v tomto roztoku koncentrácia chloridu sodného na 0,15 mól/l diañltráciou a nakoniec sa vykoná lyoñlizácia.Aby sa prípadne obsiahnutý pôvodca choroby inaktivoval, táto frakcia sa zahrieva podľa návodu daného v AT-B 385 657 počas 10 hodín na teplotu 60 °C a počas jednej hodiny na teplom 80 °C. Aktivita protrombínu je 5 250 jednotiek. Protrombín sa rozpustí na roztok obsahujúci 2,5 jednotiek na mililiter a pomaly sa mieša s 2,5 mmól/l chloridu vápenatého za teploty 30 °C pri hodnote pH 7,0. Po 80 minútach sa stanoví aktivita trombínu (pomocou chromogénneho substrátu Ih-l firmy IMMUNO AG, Viedeň) 48 jednotiek na l jednotku faktom II.Ochladením na teplom 4 °C a prídavkom kyseliny etyléndiaminotetraoctovej (EDTA) sa zastaví tvorba trombínu. Pomocou ultrafiltrácie a/alebo diafiltrácie s použitím ultrafiltračnej membrány (veľkosť pórov l 0 000) sa odstráni vápenatý komplex. Nakoniec sa koncentrát upraví na farmaceutický prípravok.20 ml roztoku obsahujúceho FEIBA (firmy IMMUNO AG, Viedeň) s aktivitou FEIBA 966 jednotiek a 992 jednotkami faktora II sa zriedi 0,9 roztokom chloridu sodného na 330 m 1 a pomaly mieša s 2,75 mmól/l chloridu vápenatého za teploty 30 °C. Po 90 minútach dosahuje aktivita trombínu maximum 51 jednotiek na l jednotku faktora II. Aktivácia sa zastaví ochladením roztoku na teplotu 4 °C a pridavkom citronanu sodného.Trombín s aktivitou 20 000 jednotiek, pripravený podľa príkladu 1, sa adsorbuje na stĺpci 20 ml S-sefarózy pri vodivosti 10,5 mS/cm a pri hodnote pH 6,0. Nakoniec sa všetko premyje 140 m 1 ISO-mílimolámeho roztoku chloridu sodného, aby sa odstránili neviazaně proteíny.Frakcie obsahujúce trombín sa eluujú 100 m 1 750 - milimolámeho roztoku chloridu sodného, skoncentrujú, diañltmjú a nakoniec upravia na farmaceutický prípravok.Výťažok aktivity trombínuje väčší ako 90 .Trombín s aktivitou 10 000 jednotiek, pripravený podľa príkladu l, sa vnesie na stlpec 10 m 1 lyzín - sefarózy ekvilibrovaný 150 - milimolárnym roztokom octanu sodného s hodnotou pH 6,7. Naplnený stĺpec sa premyje rovnakým pufrom a frakcie obsahujúce trombín sa eluujú 300 - milimolámym roztokom lyzínu.Aktivita trombínu je 9 400 jednotiek a špecifická aktivita je 1 850 jednotiek na mg proteínu.1. Spôsob výroby trombínu zabezpečeného proti virusom, vyznačujúci sa tým, žesaaktivovaný protrombínový komplex, získateľný z plazmovej frakcie obsahujúcej protrombínový komplex, spracuje na inaktívâ ciu infekčných látok a k spracovanćmu aktivovanćmu protrombínovému komplexu sa pridajú soli aktívne pri zrážaní. 2. Spôsob podľa nároku l, v y z n a č uj ú ci s a tý m , že sa trombín ďalej čistí iónomeničovou chromatograñou a/alebo añnitnou chromatografiou.

MPK / Značky

MPK: A61K 38/48, C12N 9/74

Značky: spôsob, zabezpečeného, vírusom, výroby, proti, trombínu

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/3-279193-sposob-vyroby-trombinu-zabezpeceneho-proti-virusom.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob výroby trombínu zabezpečeného proti vírusom</a>

Podobne patenty