Sposob stanovenia bielkovín detekčnou technikou striebrom

Číslo patentu: 259363

Dátum: 17.10.1988

Autor: Marcinka Kamil

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

UMD no VYNÁLEZV l A gumy 415 Vydane 15 03 89(75) Autor vynálezu MARCINKA KAMIL ing. CSC., BRATISLAVA(54) Spôsob stanovenia bielkovín detekčnou technikou striebrnmRiešenie sa týka spôsobu stanovenia bielkovín detekčnou technikou stríebrom použitím amoniakálneho strieborného komplexu. Platňový gél sa po elektroforetickej frakclonácií bielkovín preperie fixačno-vymývacím roztokom pozostávajúcim zo zmesi metanol, kyselina octová, voda a glutaraldehyd v objemových pomeroch 50 12 38 0,2 až 0,5, gél sa ďalej premýva vodou a pôsobí sa naň roztokom amoniakálneho strieborného komplexu. Potom sa gél premýva roztokom hydroxidu sodného a vyvolá sa roztokom kyseliny citrónovej a formaldehydu. Metóda má použitie na stanovenie malých množstiev bielkovín a to najmä v biochemických pracoviskách, ale aj pivovarnictve, farmaceutickom priemysle a pod.Vynález sa týka spôsobu stanovenia bielkovín detekčnou technikou striebrom použitím amoniakálneho strieborného komplexu.Metódu stanovenia bielkovín, kde sa namiesto amoniakálneho strieborného komplexu používa roztok dusičnanu strieborného uviedli Merril a spolupracovníci Electrophoresis 3, 17, 1982. Na dosiahnutie optimálneho výsledku treba po farbení gél trikrát odfarblť a znovu zatarbit, ostáva však pozadie. Sammons a spol. vyvinuli metódu,ktorou sa docielia u zafarbených bielkovín rôzne farebné odtiene, ktoré však majú intenzívne žltooranžové pozadie E 1 ectrophoresis 2, 135, 1981. Porovnanim šiestich metód farbenia striebrom v laboratóriu tohto autora je táto metóda hodnotená ako najlepšia 0 chs D. C., Mc Conkey E. H. a Sammens D. W. Electrophoresis 2, 304, 1981). Guevav a spol. pridávajú do všetkých roztokov 20 etanol na zvýšenie citlivosti metódy a zníženie intenzity pozadia Electrophoresis 3, 197, 1982. Oshawa K. a Ebata N. používajú na tixovanie bielkovín a odvodnenie gélu 70 0/0 roztok polyetylénglykolu 2 000 Anal. Biochem. 135, 409, 1983. Pri reprodukovaní tejto metódy vzniklo veľmi intenzívne šedočierne pozadie, takže výsladký .nebolo možno hodnotit. .Pranie gélu V 10 vodnom roztoku glutaraldehydu prvý uviedol Oakley a spol. Anal. Biochem. 105,361, 1980. Takto spracované gély majú však intenzívne šedé až hnedošedé pozadie.Uvedené nevýhody doterajších metód sta-novenía bielkovín odstraňuje spôsob stanovenia podľa vynálezu, ktorého podstata spočíva V tom, že sa platňový gél po elektroforetickej frakcionácii bielkovín prepiera dvakrat 30 minút íixačno-vymývacím roztokom pozostávajúcim zo zmesi metanol, kyselina octová, voda a glutaraldehyd V objemových pomeroch 50 12. 38 0,2 až 0,5, potom sa gél 30 až 40 min. premýva vodou a 10 až 20 minút sa naň pôsobí roztokom amoniakalneho strieborného komplexu, pozostávajúceho s výhodou zo zmesi roztokov 0,1 M hydroxidu sodného, 26 hydroxidu amonneho, 20 dusičnanu strieborného a vody v objemových pomeroch 10 0, 42 1, 65 88, po ktorom sa gél premyje 20 až 30 minút 0,001 M hydroxidom sodným a nakoniec sa vyvolá roztokom 0,005 °/o-nej kyseliny citrónovej a 0,1 (Vo-ného formaldehydu. Výhoda uvedeného spôsobu stanovenia bielkovín spočíva v tom, že sa výrazne zvýši účinok glutaraldehydu (použije sa jednaštyridsiatina oproti doterajším spôsobom),súčasne sa prakticky odstráni vplyv glutaraldehydu na pozadie gélu. Okrem toho praním gélu alkalickým roztokom po pôsobení amoniakálneho strieborného komplexu sa z gélu vymyjú zvyšky strieborných iónov a tým sa dosiahne, že zafarbené gély majú zanedbatelné pozadie pri zachovaní vysokej citlivosti a reprodukovatelnosti stanovenia. Údaje v 9/0, pokial nie je uvedené ináč, vyjadrujú koncentráciu látky V roztoku, t. j. v gramoch na 100 ml roztoku.Po skončení elektroiorézy sa gél s plochou 150 cm a hrúbkou 1 mm perie (ĺVakrát 30 minút vo fixačno-vymývacom roztoku pozostávajúcom zo zmesi metanol, kyselina octová a voda a glutaraldehyd v objemovom pomere 50 12 38 0,25, potom sa premyje 30 minút vodou, na premytý gél sa pôsobí 15 minút roztokom amoniakálneho strieborného komplexu pripraveného zmiešaním roztokov 0,1 M hydroxidu sodného,260/0 hydroxidu amönneho, 20 dusičnanu strieborného a vody v objemovom pomere 10 0,42 1,65 88, gél sa ďalej vymyje 0,001 M hydroxidom sodnýrn 30 minút a potom sa vyvolá roztokom 0,005 (Vo-nej kyseliny citrónovej a 0,1 °/o-neho formaldehydu počas 2 až 3 min. V takto spracovanom géle sa proces vyvolávania zastaví 10 min. praním v roztoku 20 (Vo-ného metanolu a 0,05 °/onej kyseliny citrónovej. Nasledujúcim jednotlivým praním v 500 m 1 vody pri jednej výmene vody za čerstvú., sa získa gél vhodný na vyhodnotenie.Postupovalo sa ako v príklade 1 s tým rozdielom, že tixačno-umývací roztok obsahoval 0,5 glutaraldehydu, po ňom sa gél premýval 45 minút vodou. Po aplikácii roztoku amoniakálneho strieborného komplexu sa gél vymýval 40 minút.vynález je možné využiť všade tam, kde je potrebné stanoviť velmi malé množstvá bielkovín, analyzovaných v platňových polyakrylamidových géloch. je to najmä v biochemických pracoviskách najrôznejšieho zamerania, v klinických laboratóriách i v niektorých priemyselných odvetviach napr. v pivovarnictve, farmaceutickom priemysle a pod.1. Spôsob stanovenia bielkovín detekčnou technikou strlebrom po elektroforetickej frakcionącii bielkovín, vyznačujúci sa tým,že platňový gél sa po elektroioretickej frakcionácii bielkovín prepiera dvakrát po dobu do 30 minút fixačno-vymývacím roztokom pozostávajúcim zo zmesi metanol, kyselina octová, voda a glutaraldehyd v objemových pomeroch 50 12 38 0,2 až 0,5,potom sa gél 30 až 40 minút premýva vodou a 10 až 20 minút sa naň pôsobí roztokom amoniakálneho strieborného komplexu,po ktorom sa gél premýva 20 až 30 minút roztokom hydroxidu sodného a nakoniec sa vyvolá roztokom kyseliny citrónovej a roztokom formaldehydu.2. Spôsob stanovenia bielkovín podľa bodu l, vyznačujúcí sa tým, že roztok amoniakálneho strieborného roztoku sa získa zmiešanim 0,1 M roztoku hydroxidu sodného, 26 percentného roztoku hydroxidu amónneho,20 (Vo-ného roztoku dusíčnanu strieborného a vody v objemovom pomere 10 0,42 1,65 88.3. Spôsob stanovenia bielkovín podľa bodu 1, vyznačujúci sa tým, že sa použije premývací roztok hydroxidu sodného o koncentrácii 0,001 M.4. Spôsob stanovenia bielkovín podľa bodu 1, vyznačujúcí sa tým, že sa použije 0,005 perc. roztok kyseliny citrónovej a 0,1 0/0 ný roztok formaldehydu.

MPK / Značky

MPK: G01N 33/68, G01N 33/487

Značky: striebrom, bielkovín, stanovenia, detekčnou, technikou, spôsob

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/3-259363-sposob-stanovenia-bielkovin-detekcnou-technikou-striebrom.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Sposob stanovenia bielkovín detekčnou technikou striebrom</a>

Podobne patenty