Spôsob prípravy p-difenol oxidázy

Číslo patentu: 245343

Dátum: 15.12.1988

Autori: Patrascu Ionel-victor, Neri Armando

Stiahnuť PDF súbor.

Text

Pozerať všetko

AD PRO WNÁLIZY A OBJIVYAPALOVIČ RUDOLF mg. csc., BRATISLAVA ZEMEK IŘÍ ing. csc.,LEHNICEVynälez sa týka spôsobu prípravy enzýmu p-difenol oxídázy.vynález rieši spôsob prípravy p-difenol oxidázy kultlváciou drev-okaznej huby Fomes fomentarus. Uvedeného účelu sa dosiahne tým, že izvolovaný kmeň Fomes fomentarus sa kultivuje submerzne n-a pôde s D-glukózou, kazeinom minerálnymi látkami, tiamínom, xylidinom alebo o-toluidinom v teplotnom rozmedzí Z 0 až 40 °C.vynález má využitie v medicíne, klinickej biochémii a toxikolögii a v analytickej chémii pri identifikácii škodlivín v~ prostredí.vynález sa týka spôsobu prípravy p-dite nol »oxidázy p-difenol oxigen oxidoreduktáza EC 1.10.3.2.Pri príprave p-difenol oxidázy sa vychádza obyčajne z mikroskopických húb, napr. z Aureobasidium pullulans Rösch R., Liese W., Berndt H. Arch. Mikrobiol. 67, 28 /1969/1 alebo Schiz-ophyllum commune Leonard P. j., Phillips L. E. I. Bacteriol. 7, /1973/1. Pri izolácii a purifikáoii uvedeného enzýmu sa obyčajne frakcionujú bielkoviny získané z fermentačnej pôdy zrážaním síranom amonnym, organickými rozpúštadlami alebo za použitia atinitných technik. Nevýhodou uvedených postupov je ich zdĺhavosť, náročnosť na použité materiály, predovšetkým v prípade prípravy afinantov.Uvedené nedostatky rieši postup podľa Vynálezu, využívajúoi k príprave p-difenol oxidázy drevokazné huby druhu Fomes, ktorý patrí medzi Basidiomycetes. Podstata vynálezu spočíva v tom, že drevokazná huba Fo mes fomentaru Linne ex Fries Kickx sa kultivuje submerzne na pôde zloženej z 10 až 30 hmot. dielov D-glukózy, 1 až 3 dielov k-azeínu, 0,5 až 12 dielov KH 2 PO 4, 0,1 až 0,3 diela NaH 2 PO 4. 12 H 20, 0,1 až 1 diel MgS 04,0,001 až 0,003 diela CuSO 4, 0,0005 až 0,002 diela ZnSO 4, 0,0005 až 0,002 diela MnS 04,0,005 až 0,015 diela FeSO 4, 0,005 až 0,015 diela CaICl 2, 0,00002 .až 0,00008 diela tiamínu,0,1 až 0,001 diela xylidínu alebo o-toluidínu v 1 000 dieloch vody, pričom kultivacia prebieha pri 20 až 40 °C po dobu 250 .až 750 hodín za súčasného prevzdušňovania vháňaním vzduchu rýchlosťou 0,05 až 0,2 objemového diela za minútu a v následnej iz-olácii uv-oľnenej p-difenol oxidázy ako jedinej extracelulárnej bielkoviny vysolením zrážanim organickými mzpúštadlami, alebo inými známymi postupmi.Výhodou navrhovaného postupu je jednoduchosť prípravy p-difenol oxidázy ako aj skutočnosť, že na kultivačnej pôde o horeuvedenom zložení huba Fomes fomentarus uvoľňuje ako jedinú enzýmaticky aktívnu bielkov-inu predmetný enzým do extracelulárneho prostredia.Drevokazná huba Fomes fomentarus Linno ex Fries Kiokx kmeň 191 ul-ožený v Zbierke kultúr drevokazných húb Štátneho dre 4várskeho výskumného ústavu v Bratislave sa kultlvovala V desiatich Erlenmayerových bankách objem 2 1, obsahujúcich 400 mi kultivačnej pôdy zloženej z 10 g D-glukózy,1 g kazeínu, 0,5 g KH 2 PO 4, 0,1 g NaH 2 PO 4..12 H 20, 0,1 g MgSO 4, 1 mg CuSO 4, 5 mg ZnSO 4, 0,5 mg MnSO 4, 5 mg FeSO 4, 5 mg Caclz, 0,02 mg tiamínu a 0,001 g o-toluidinu v 1 000 m vody po dobu 750 hodín pri teplote 20 T na kultivačnom zariadení o frekvencii 20 kmitov za minútu a amplitúde 25 cm.Po oddeleni mycélia centriíugáciou pri 1 500 g po dobu 15 minút sa získaný supernatant zräžal siranom amónnym do nasýtenia roztoku. Získané zrazenina, odpovedajúca 4 l kultivačnej pôdy -obsahovala 1,2 g bielkoviny p-diifenoi oxidazy o aktivite 24 kat.Postupuje sa ako v príklade 1 s tým rozdielom, že sa použil kmeň Fomes fomentarus 22 rovnakej zbierky, ako je uvedené v príklade 1, ktoré sa kultivoval submerzne vo fermentore o objeme 20 1, na kultivačnej pôde o zložení 30 g D-glukózy, 3 g kazeínu,2 g KH 2 PO 4, 0,3 g Na 2 l-iP 04.12 H 20, 1 gram MgSO 4, 3 mg ~CuSO 4, 2 mg ZnSO 4, 2 mg MnSO 4,15 mg FeSO 4, 15 mg Caclz, 0,08 mg ti-amínu a 0,1 g xylidínu v 1 litri pôdy pri 40 0 G, po dobu 250 hodín za prevzdušñovania rýchlostou 0,05 l vzduchu za minútu na 1 liter kultivačnej pôdy.Po odstránení biomasy sa získaný supernatant v množstve 20 l zrážal 96 etanolom v- objemovom pomere 1 5. získaná zrazenina obsahovala 6,5 g bielkoviny, obsahu.jücej výlučne p-difenol oxiclazu o aktivite 200 kat.Postupuje sa ako v príklade 2 s tým rozdielom, že sa kuitivačná pôda prevzdušňuje sterilným vzduchom o rýchlosti 0,2 1 na 1 liter kultivačnej pôdy za minútu. Po spracovaní, tak ako je uvedené v- príklade 2 sa získalo 6,4 g bielkoviny, obsahujúcej výlučne p-difenol -oxiclázu o aktivite 216 ,ukatvynález môže nájsť široké uplatnenie v medicíne, klinickej biochémii a toxikolôgii a v analytickej chémii pri identifikácii škodliv-ín v životnom prostredi.Spôsob prípravy p-difenol oxidázy vyznačený tým, že drevokazná huba Fomes f~omen« tarus Linne ex FríesKickx sa kultivuje submerzne na pôde zloženej z 10 až 30 hmot. dielov D-glukózy, 1 až 3 dielov kazeínu, 0,5 až 2 dielov KH 2 PO 4, 0,1 až 0,3 diela NaHPO 4.0,1 diela xylidínu .alebo o-toluidínu v 1000 dieloch vody, pričom kultivácia prebieha pri 20 až 40 °C po dobu 250 až 750 hodín za sú~ časného prevzdušňovuanía vháňanim vzduchu rýchlosťou 0,05 až 0,2 objemového diela za minútu a v následnej izolácii uvoľnenej p-difenol oxidázy, ako jedinej extracelulárnej bielkoviny vysolením, zrážaním organickými rozpüšťadlami alebo inými bežnými postupmi.

MPK / Značky

MPK: C12N 9/02

Značky: p-difenol, oxidázy, spôsob, přípravy

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/3-245343-sposob-pripravy-p-difenol-oxidazy.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Spôsob prípravy p-difenol oxidázy</a>

Podobne patenty