Izolovaný OMP106 polypeptid alebo jeho fragment, vakcína a antigénový prostriedok s ich obsahom, izolovaná DNA, izolovaná protilátka a ich použitie

Číslo patentu: 284812

Dátum: 14.11.2005

Autori: Tucker Kenneth, Plosila Laura

Je ešte 21 strana.

Pozerať všetko strany alebo stiahnuť PDF súbor.

Zhrnutie / Anotácia

Je opísaný izolovaný OMP106 polypeptid, ktorý je polypeptidom vonkajších membrán Moraxella catarrhalis, a má molekulovú hmotnosť asi 180 kD až asi 230 kD podľa určenia pomocou SDS polyakrylamidovej gélovej elektroforézy, peptidový fragment z OMP106 polypeptidu, izolovaná protilátka, vakcína, antigénový prostriedok a izolovaná DNA. Ďalej je opísané použitie polypeptidu, peptidového fragmentu a izolovanej protilátky na prípravu liečiva na liečenie alebo prevenciu infekcie s Moraxella catarrhalis.

Text

Pozerať všetko

Vynález sa všeobecne týka vonkajšieho membránového proteín-l 06 (OMPl 06) polypeptidu z Moraxella catarrhalis. Vynález zahmuje čistený OMPl 06 polypeptid a polypeptidy zneho odvodené (OMPl 06-odvodené polypeptidy). Vynález tiež zahrnuje protilátky, vrátane cytotoxických protilátok, ktoré špecificky viažu OMPl 06 polypeptíd a/alebo OMPl 06-odvodené polypeptidy. Vynález ďalej zahmuje profylaktické alebo terapeutické zmesi, vrátane vakcin, ktore obsahujú OMPl 06 polypeptid a/alebo OMPl 06-odvodené polypeptídy. Vynález okrem toho poskytuje spôsoby indukovania ímunitných odoziev na M. catarrhalis u cicavcov. Vynález ďalej poskytuje izolované nukleotidové sekvencie kódujúce OMPl 06 polypeptid a OMP 106-odvodené polypeptidy, vektory, ktoré majú tieto sekvencie, a hostiteľské bunky obsahujúce tieto vektory.Moraxella catarrhalis, tiež známa ako Moraxella(Branhamella) camrrhalis alebo Branhamella catarrhalis a skôr známa ako Neisseria catarrhalis alebo Micrococcus catarrhalis, sú gram-negatívne baktérie často nachádzané v respiračnom trakte ľudí. M. catarrhalis, ktoré sa pôvodne nepovažovali za nebezpečné symbioticke organizmy, sú teraz spoznané ako dôležitý patogén v infekciách horného a dolného respiračného traktu zvierat. U ľudí spôsobuje M. catarrhalís vážne infekcie v dolnom respiračnom trakte dospelých s chronickou chorobou pľúc, systémické infekcie u pacientov s oslabenou imunitou, a zápal stredného ucha a zápal prinosových dutín u dojčiat a detí. Pozri Helminen a spol., 1993, lnfect. lmmun. 6122003 až 2010 Catlin, B. W.,1990, Clin. Microbiol. Rev. 32293 až 320 a odkazy tam citované.Proteíny vonkajšej membrány a ochranné protilátkyZložky vonkajšieho povrchu Moraxella Catarrhalis sa študovalí ako pokus pochopiť patogénny proces infekcie M catarrhalís a vyvinúť užitočné terapeutické liečebné metódy a profylakticke opatrenia proti takejto infekcii. Proteíny vonkajšej membrány (OMP) dostali zvlášť pozoruhodnú pozomost ako možne faktory virulencie a ako potenciálne vakcínové antigény. M. catarrhalis má okolo 10 až 20 rôznych OMP, pričom 6 až 8 z nich, OMP A až H, ako prevládajúce látky (Murphy a Loeb, 1989, Microbial Pathogen. 6159 až 174). Molekulové hmotnosti OMP A až H sú v rozsahu od 97 do 20 kD. Pozri Bartos a Murphy, 1988, J. lnfect. Dis. 158 761 až 765 Helminen a spol., 1993, lnfect. lmmun. 61 2003 až 2010 Murphy a spol., 1993,Molecul. Microbiol. 10 87 až 97 a Sarwar a spol., 1992,lnfect. lmmun. 60 804 až 809. Porovnania proteinových proñlov pomocou gélovej elektroforézy na sodnom dodecylsulfát polyakrylamide (SDS-PAGE) preparátov vonkajšej membrány z 50 M. catarrhalís kmeňov majú takmer homogćnne obrazy OMP A až l-l (Bartos a Murphy, 1988,J. lnfect. Dis. 15876 l až 765).Okrem OMP A až H sa OMP s vysokou molekulovou hmotnosťou, označované ako HMW-OMP, ktoré majú zdanlivú hmotnosť 350 až 720 kD podľa SDS-PAGE, tiež identiíikovali ako ďalšie prominentné povrchové zložky prítomné V mnohých kmeňoch M catarrhalis. HWM-OMP pri denaturácii kyselinou mravčou tvorí jednoduchý pás 120 až 140 kD a teda sa javí ako oligomćmy proteín (Klingman a Murphy, 1994, lnfect. lmmun. 621150 až 1155). HMW-OMP sa javí ako rovnaký proteín, ako je proteínoznačovaný UspA l-lelminenom a spol., (1994, J. lnfect. Dis. 1702867 až 872) a ukázalo sa, že je prítomný V mnohých kmeňoch M. calarrhalis.Pri intaktých baktériách alebo z baktérií získaných mechúrikov vonkajšej membrány, viaceré z identifikovaných OMPs predstavujú povrchovo exponované epitopy, ktoré vyvolávajú tvorbu protilátok, ktoré viažu OMP. Tieto antigénové OMP zahmujú OMP E a OMP G (Murphy a Bartos, 1989, lnfect. lmmun. 57 2938 až 2941) OMP C/DTerapeutický potenciál protilátok na povrchovo-exponované epitopy CopB a UspA sa vyhodnotí na modeli so zvieratami. Model zahmoval priame bolusové naočkovanie do pľúc BALB/c VAF/Plus myší kontrolovaného počtu buniek M. catarrhalis a následné sledovanie rýchlosti pulmonálneho k 1 írensu baktérií (Unhanand a spol., 1992, J. lnfect. Dis. 165 644 až 650). Rôzne klinické izoláty M. catarrhalis malí rôzne rýchlosti klírensu, ktoré korelovali s hladinou granulocytového posilnenia na infikovanom mieste. Pasívna imunizácia s monoklonálnymi protilátkami určenými proti povrchovo-exponovanému epitopu, buď CopB, alebo UspA, zvýšila rýchlosť pulmonálneho k 1 írensu M. catarrhalis (Helminen a spol., 1993, lnfect. lmmun. 61 2003 až 2010 Helminen a spol., 1994, J. lnfect. Dis. 170 867 až 872).Priľnavost bakteriálnych patogénov na povrch hostiteľských buniek podporuje kolonizáciu a iniciuje patogenézu. Pozri EH. Beachey, 1981, J. lnfect. Dis. 143 325 až 345. Gram-negatívne baktérie typicky prejavujú povrchové lectíny, ktoré sa viažu na špecifické oligosacharidy glykoproteíny a/alebo glykolipidy na povrchu hostiteľskej bunky. Takéto lectíny sú často spojené sproteínovými strapcami alebo vláknamí v stenách baktérií. Bakteriálne priľnavost sa tiež môže vyskytovať pri nešpeciñckom viazaní v dôsledku hydrofóbnej a/alebo nábojovej interakcie s povrchom hostiteľskej bunky.Mechanizmus priľnutia M. catarrhalis na bunky v respiračnom trakte zostáva slabo pochopeným. Organizmy sa priľnú na kultivovane ľudské orofaryngeálne epitelové bunky (Mbaki a spol., 1987, Tohuku J. Exp. Med. 153 lll až 121). Štúdium Rikitomiho a spol. ukazuje, že proteínové strapce vstenách baktérií môžu mat úlohu pri priľnuti na takéto bunky, pretože denaturácia proteínových strapcov v stenách, alebo opracovanie s protilátkami proti týmto strapcom, znížilo priľnutie strapcovitými kmeňmi (Rikitomi a spol., 1991, Scand. J. lnfect. Dis. 232559 až 567). Proteínovými strapcami sprostredkované viazanie však nemôže byt jediným základom tohto priľnutia, pretože najpríľnavejší kmeň spomedzi rôznych preskúmaných kmeňov, bol nestrapcovitý kmeň.Reakcie zrážania krvi často nahradzujú komplikovanejšie skúšky priľnavosti pri klasiñkovani bakteriálnych adhézií. Ale Rikitomi a spol. nezistili koreláciu medzi priľnavosťou ľudských orofaryngeálnych epitelových buniek a zrážaním krvi s M. catarrhalis kmeňmi (ld.). Teda trikrát viac priľnavé kmene nezrážali ľudské erytrocyty. Priľnavosť ľudských orofaryngeálnych epitelových buniek a zrážanie teda zahmovali rôzne mechanizmy viazania.Naproti tomu nedávna štúdia Kellensa a spol. ukazuje,že zrážanie krvi s M. catarrhalís je korelované spriľnavosťou hostiteľskej bunky (Kellens a spol., 1995,lnfection 23 37 až 41). Ale táto štúdia použila skúšku pri SK 284812 B 6ľnavosti založenú na bakteriálnom viazaní na tracheálne rezy ošípanej. Je nejasné, či sa tracheálne tkanivo ošípanej môže považovať za homologické k ľudskému tkanivu respiračného traktu vzhľadom na priľnavosť patogénnych kmeňov M. catarrhalis.Napriek problematickej skúške priľnavosti, Kellens a spol. preskúšali aktivitu zrážania krvi osemdesiatich klinických izolátov M. catarrhalis (Kellens a spol., 1995, lnfection 23 37 až 41). Takmer tri štvrtiny skúmaných kmeňov zrážali ľudské, králíčie, morčacie, psie alebo potkanie erytrocyty, kým ostatné kmene to nerobili. Aktivity zrážanía krvi niektorých kmeňov zrážajúcich krv sa ďalej charakterízovali a ukázali sa ako závislé od vápnikového iónu a inhibované digesciou trypsínom alebo vysoko-teplotným opracovanim, alebo prídavkom D-glukózaminu alebo D-galaktózaminu.Prieskum hemaglutinačných a ne-hemaglutinačných M. catarrhalis kmeňov Tuckerom a spol. ukázal, že všetky kmene viažu glykolipid gangliotetraozylceramidu, ale len hemaglutinačnć kmene viažu glykolipid globotetraozylceramidu (Tucker a spol., 1994, Annual Meeting of Amer. Soc. Microbiol., Abstrakt č. D 124). Navyše sa ukázalo, že M. catarrhalís hemaglutinačná aktivita sa inhibuje rôznymi monosacharidmi, ktoré obsahujú sacharidovú skupinu globotetraozylceramidu. Tieto pozorovania viedli Tuckera a spol. k tvrdeniu, že M catarrhalis zráža krvinky naviazaním na globotetra-ozylceramidy v bunkových membránach citlivých erytrocytov, vrátane buniek ľudských červených krviniek. Doteraz v tejto oblasti nebola identiñkovaná molekula na vonkajšom povrchu M. catarrhalis, ktorá je zodpovedná aj za priľnavost hostiteľskej bunky aj za zrážanie krviniek.Citacia alebo identifikácia odkazov v tejto sekcii alebo ktorejkoľvek inej sekcii tejto prihlášky by nemala byť zostavená ako znak, že takýto odkaz je dostupný ako doterajší stav techniky pre tento vynález.Tento vynález zahmuje OMPl 06 polypeptid M catarrhalis a OMP 106-odvodené polypeptidy a spôsoby výroby týchto polypeptidov. Vynález tiež zahmuje antiséra a protilátky, vrátane cytotoxických protilátok, špecifických pre OMPl 06 polypeptid a/alebo OMPl 06-odvodené polypeptidy. Vynález ďalej zahmuje imunogénne, profylaktické alebo terapeutickć zmesi, vrátane vakcín, obsahujúce jeden alebo viaceré z týchto polypeptidov. Vynález okrem toho zahmuje nukleotidové sekvencie kódujúce tieto polypeptidy. Vynález ďalej zahmuje imunogénne, profylaktické alebo terapeutické zmesi, vrátane vakcín, obsahujúce utlmený alebo inaktivovaný ne-herrtaglutinačný kultivar M. catarrhalis.Tento vynález má mnohé užitočné vlastnosti. Napríklad OMPl 06 polypeptid a OMPl 06-odvodené polypeptidy sa môžu použiť ako ligandy na detegovanie protilátok vyvolávajúcich odozvu infekcie M. catarrhalís (napríklad, pri diagnóze M. catarrhalis infekcie). OMPl 06 polypeptid a OMPl 06-odvodené polypeptidy môžu tiež byt použité ako imunogény na indukovanie M. catarrhalís-špecifických protilátok. Takéto protilátky sú užitočné pri imunoskúškach na detegovanie M. catarrhalis V biologických vzorkách. Cytotoxické protilátky podľa tohto vynálezu sú užitočné pri pasívnych imunizáciách proti M. catarrhalis infekcii. OMPl 06 polypeptid a OMPl 06-odvodené polypeptidy môžu ďalej byt použité ako aktívne zložky vakcín proti M. catarrhalis infekcii.Vynález je založený na prekvapívom zistení, že hemaglutinačné M. catarrhalis kmene a kultivary majú proteín vonkajšej membrány, OMPl 06 polypeptid, ktorý má molekulovú hmotnosť okolo 180 kD až okolo 230 kD a proteín vonkajšej membrány nehemaglutinačných M. catarrhalis kmeňov a kultivarov alebo nemá OMPl 06 polypeptid, alebo majú nevhodne modiñkovaný OMPl 06 polypeptid, ktorý je neaktívny pri zrážaní krviniek a nie je zafarbiteľný striebrom. Vynález je ďalej založený na zistení, že polyklonálne antisérum indukovanć pomocou OMPl 06 polypeptidu izolovaného z hemaglutinačného kmeňa M catarrhalis má cytotoxickú aktivitu proti rôznym hemaglutinačným M. catarrhalís kmeňom, ale nie proti nehemaglutinačným M. catarrhalis kmeňom.vynález poskytuje izolovaný alebo v podstate čistý OMPl 06 polypeptid M. catarrhalis. OMPl 06 polypeptid obsahuje celý proteín alebo podjednotku proteínu vloženú alebo umiestnenú na vonkajšom povrchu vonkajších membrán hemaglutinačných (HA) kmeňov a mnohých nehemaglutinačných (NHA) kmeňov a kultivarov M. catarrhalis. OMPl 06 prispieva priamo alebo nepriamo hemaglutinačnému fenotypu HA kmeňov a kultivarov. Podľa tohto vynálezu, HA M catarrhalis bunky zrážajú ľudské alebo králičie erytrocyty pri štandardnej hemaglutínačnej skúške tak, ako je ukázane Soto-Hemandezom a spol. 1989, J. Clin. Microbiol. 27 903 až 908. Hoci sa nechceme obmedziť akýmkoľvek konkrétnym mechanizmom pôsobenia,súčasne sa predpokladá, že M catarrhalis zráža erytrocyty naviazaním na globotetrózovú (Gb 4) skupinu glykolipidových a glykoproteinových receptorov na povrchoch hostiteľskej bunky a že hemaglutinačná aktivita je čiastočne sprostredkovaní príslušne modifikovaným OMPl 06 polypeptidom, ktorý má zvláštnu vlastnosť V tom, že je citlivý na vyfarbovanie striebrom. Naproti tomu, nemodiñkovaný alebo nevhodne modífrkovaný OMPl 06 polypeptid nie je ani aktívny pri sprostredkovaní hemaglutinácie ani nie je vyfarbiteľný striebrom. Navyše, OMPl 06 polypeptid je jediný polypeptid, ktorý má zdanliwi molekulovú hmotnosť okolo 180 kD až okolo 230 kD pri SDS-PAGE, ktorý je 0 G- alebo sarkozyl-extrahovateľný z HA alebo NHA M. catarrhalis pľuzgierikov alebo intaktných buniek.Hemaglutinačná aktivita HA M. catarrhalís buniek je inhibovaná pomocou globotetrózy (GalNAcBl-3 Gala 1-4 GalBI-4 GICBI Gb 4) a monosacharidmi, ktore obsahujú Gb 4, vrátane N-acetyl-D-galalctózamínu, D-galaktózy a glukózy, a ich derivátov, ako napríklad metyl-cL-galaktózy alebo metyl-B-galaktózy. Hemaglutinačná aktivita HA M. catarrhalis buniek je tiež inhibovaná relatívne vyššími koncentráciami mnohých iných cukrov vrátane, ale bez obmedzenia na ne, D-manózy, L-fukózy, D-glukózy a N-acetyl-D-glukózamínu.Hemaglutinačná aktivita a OMPl 06 polypeptid intaktných HA M. catarrhalis buniek sú oba znižovaní alebo deštruované digesciou intaktných M. catarrbalis buniek pomocou rôznych proteáz vrátane, ale bez obmedzenia na ne, TLCK (Nor-ptozyl-L-lyzín-chlórrnetylketón tiež známy ako l -chlór-3 -tozylamino-7-amino-L-2-heptanón) - opracovaný chyrnotrypsín, proteináza K a TPCK (N-tozyl-L-fenylalanín-chlórmetyl ketón)-opracovaný trypsín. Digescia proteázou V 8 intaktných HA M. catarrhalis buniek však nepôsobí ani na hemaglutinačnú aktivitu ani na fyzickú integrítu OMPl 06 polypeptidu takýchto buniek.Nehemaglutinačný (NHA) kultivar sa môže získat z HA M. catarrhalis kmeňa alebo kultivaru pomocou sériovej pasáže V statických kvapalných kultúrach (t.j., kvapal SK 284812 B 6ných kultúrach udržiavaných pri 35 °C bez pretrepávania). Napríklad kmeň HA M. catarrhalis alebo kultivar sa pestoval v Mueller Hintonovom bujóne a každých päť dní sa inokulum odobralo z povrchu statickej kultúry na očkovanie následnej statickej kultúry, Výhodné inokulum je plávajúci chumáč buniek na povrchu kultúry. Pasážovanie statických kultúr je udržiavané dovtedy, kým sa tvorí NHA kultívar. NHA kultivar podľa tohto vynálezu môže byt použitý na výrobu ochranných vakcín, ako napríklad vakcin s úplnými bunkami, proti infekcii M catarrhalís.Naproti tomu hemaglutinačný fenotype HA M. catarrhalis kmeňa alebo kultivaru sa môže udržiavať pasážovaním kmeňa alebo kultivaru v pretrepávaných kvapalných kultúrach. V jednom uskutočnení sa HA M. catarrhalís kmeň alebo kultivar pestuje v Muellerovom Hintonovom bujóne pri 35 až 37 °C s pretrepávaním s okolo 200 ot./min. a pasážoval sa každých 24 až 48 hodín. Hemaglutinačný fenotyp HA M. catarrhalis kmeňa alebo kultivaru sa tiež môže udržiavať pasážovaním na tuhom médiu. Napríklad,HA M catarrhalis kmeň alebo kultivar sa pestuje na platni obsahujúcej krvný agar alebo Muellerov Hintonov agar.OMP 106 polypeptid podľa tohto vynálezu je samostatný protein vonkajších membrán HA M. catarrhalis kmeňa alebo kultivaru, ktorý má zdanlivú molekulovú hmotnost pri SDS-PAGE okolo 180 kD až okolo 230 kD, výhodne okolo 190 kD. Podľa tohto vynálezu je protein vonkajších membrán M. catarrhalis polypeptid, ktorý je prítomný v M catarrhalis pľuzgierikoch, alebo ktorý sa môže extrahovat z M catarrhalís pľuzgierikov alebo intaktných buniek pomocou n-oktyl-B-D-gluko-pyranozidu (OG) alebo sarkozylového detergentu V pufrovom roztoku pri laboratómej teplote. Pozri Murphy a Loeb, 1989, Microbial Pathogenesis 6 159 až 174, na diskusiu M catarrhalis pľuzgierikov,ktorými sú prirodzene sa vyskytujúce mechúríky pozostávajúce z vonkajších membrán M catarrhalis. NHA M. catarrhalis kmene alebo kultivary bud nemajú OMP 106 polypeptid, alebo nemajú OMP 106 polypeptid vo forme,ktorá viaže anti-OMP 106 protilátky (pozri odsek 5., infra) ale nereagujú pri vyfarbovaní striebrom (t.j. s použitím Silver Stain Plus od BioRad (Richmond, CA), alebo postupom opísaným Gottliebom a Chaukom, 1987, Anal. Biochem. 165 33). Naproti tomu OMP 106 polypeptid z HA M catarrhalis kmeňov alebo kultivary viažu anti-OMP 106 protilátky a reagujú pri vyfarbovaní striebrom.OMP 106 polypeptid môže byt identiñkovaný v HA M catarrhalis pľuzgierikoch alebo intaktných bunkách pomocou jeho citlivosti ku degradácii opracovanim proteázou,ktorá tiež odstraňuje alebo zoslabuje hemaglutinačnú aktívitu rovnakého HA kmeňa (pozri odstek l. pre príklady proteáz, ktoré deštruujú alebo nedeštruujú hemaglutinačnú aktivitu intaktných M catarrhalis buniek). Inými slovami,digescia sproteázou, ktorá deštruuje alebo znižuje hemaglutinačnú aktivitu HA kmeňa alebo kultivaru bude tiež menit pri SDS-PAGE, zastúpenie alebo umiestnenie OMP 106 polypeptidu izolovaného z kmeňa alebo kultívaru po takejto digescii v porovnaní s polypeptidom rovnakého kmeňa alebo kultivaru pred digesciou.OMP 106 polypeptid sa tiež môže identifikovať ako polypeptid v 0 G alebo sarkozylovom extrakte M catarrhalis pľuzgierikov alebo intaktných buniek, ktorý má zdanlivú molekulovú hmotnost väčšiu než 106 kD podľa určenia pomocou denaturačnej gélovej elektroforézy v 12 hmotnosmých PAG s SDS, s použitím prípravkov, ako je opísané v Harlow a Lane (Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Har bor, NY, Appendix l, 1988). Tepelné opracovanie 0 G alebo sarkozylového extraktu pri 100 °C počas 5 minút môže spôsobiť, že OMP 106 polypeptid má mat zdanlivú molekulovú hmotnosť okolo 180 kD až okolo 230 kD podľa určenia pomocou SDS-PAGE v 6 hmotnostných PAG bez redukujúcich činidiel, s použitím prípravkov, ako je opísane V Harlow a Lane, rovnaká citácia. V konkrétnom uskutočnení, OMP 106 polypeptid vtepelne opracovanom 0 G alebo sarkozylovom extraktc M catarrhalís lmieňa ATCC 49143 má zdanlivú molekulovú hmotnost okolo 190 kD, V niektorých uskutočneniach OMP 106 polypeptidom je polypeptid pripravený z M catarrhalis kmeňov vrátane, ale bez obmedzenia na ne, AT CC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617, ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628. Výhodný zdroj OMP 106 polypeptidu je HA kultivar takýchto kmeňov. Výhodnejšim zdrojom je HA kultivar ATCC 49143.V určitom uskutočnení OMP 106 polypeptid obsahuje,výhodne na amino-zakončení, aminokyselinovú sekvenciu IGISEADGGKGGANARGDKSIAIGDIAQALGSQSIAIG DNKIV (Sekvencia ID NOl) alebo sekvenciu v podstate ku nej homologickú. OMP 106 polypeptid môže okrem toho obsahovať, karboxyl-vzdialený od vyššie zmienenej sekvencie, oktapeptid, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu GTVLGGKK (Sekv. ID N 022) alebo sekvenciu v podstate ku nej homologickú. V tomto dokumente sa používa ako v podstate homologická aminokyselinová sekvencia taká,ktorá je najmenej 80 , výhodne 100 , identická s uvedenou aminokyselinovou sekvenciou.Podľa rôznych aspektov vynálezu, polypeptidy podľa tohto vynálezu sú charakterizované ich zdanlivou molekulovou hmotnosťou založenou na polypeptidovej migrácii pri SDS-PAGE blízkej na migráciu markerov známej molekulovej hmotnosti. Hoci sa môžu použiť štandardy molekulovej hmotnosti známe v odbore pri SDS-PAGE, výhodne markery molekulovej hmotnosti zahmujú aspoň králičí skeletálny svalový myozín, E. coli ,ů-galaktozidázu a králičiu svalovú fosforylázu B, Odbomík v tejto oblastí ohodnotí, že polypeptidy podľa tohto vynálezu môžu migrovať rozdielne v rôznych typoch gélových systémov (napriklad rôznych pufroch rôznych koncentráciách gélu, zosieťujúcim činidlom alebo SDS). Odbomík v tejto oblasti tiež ohodnotí, že polypeptidy môžu mať rôznu zdanlivú molekulovú hmotnosť V dôsledku rôznych markerov molekulovej hmotnosti použitých pri SDS-PAGE. Teda charakterizácia molekulovej hmotnosti polypeptidov podľa tohto vynàlezu je zamýšľana tak, že má byť určená na pokrytie rovnakých polypeptidov v akýchkoľvek SDS-PAGE systémoch a s akýmikoľvek markermi molekulovej hmotnosti,ktoré by mohli indikovať viditeľne rôzne Zdanlivé molekulove hmotnosti pre polypeptidy než tie, ktore sú opisané v tomto dokumente.OMP 106-odvodený polypeptid podľa tohto vynálezu môže byť fragmentom OMP 106 polypeptidu. Intaktný OMP 106 polypeptid môže obsahovat jeden alebo viaceré aminokyselinové zvyšky, ktoré nie sú potrebne na jeho imunogenicitu. Môže to byť vpripade napríklad vtedy, keď sú pre imunogénnu aktivitu potrebne len aminokyselinové zvyšky tvoriace zvláštny epitope OMP 106 polypeptidu. Nepotrebne aminokyselinové sekvencie sa môžu odstrániť pomocou technik dobre známych V odbore. Napríklad sa neočakávané aminokyselinové sekvencie môžu odstrániť pomocou obmedzenej proteolytickej digescie s použitím enzýmov, ako je napriklad trypsin, papaín alebo príbuzné proteolytické enzýmy alebo pomocou chemického štiepenias použitím činidiel, ako je napríklad brómlçyán a následnou frakcionáciou produktov digescie alebo štiepenia.OMPloó-odvodeným polypeptidom podľa tohto vynálezu môže tiež byt modifikovaný OMPI 06 polypeptid alebo jeho fragment (t.j. OMPI 06 polypeptid alebo fragment,ktorý má jednu alebo viaceré arninokyselinove substitúcie,vložené časti a/alebo odstránené časti divokého-typu OMPI 06 sekvencie). Takéto modifikácie môžu zvýšiť imunogenicitu výsledného polypeptídového produktu alebo môžu byt bez účinku na túto aktivitu. Modifikačné techniky, ktoré sa môžu použit, zahmujú techniky opísane v U.S. Patente č. 4,526,716.OMPIOG-odvodeným polypeptidom môže ďalej byt chimćrický polypeptid obsahujúci jeden alebo viaceré heterologícké polypeptidy kondenzované na amino-zakončenie alebo karboxylové-zakončenie, alebo inteme na úplný OMPI 06 polypeptid alebo jeho diel, alebo ů-agment. Užitočné heterologické polypeptidy obsahujúce takýto chimérický polypeptid zahmujú, ale nie sú na ne obmedzené, a) pre- a/alebo pro- sekvencie, ktoré napomáhajú transportu,translokácii a/alebo upravovaniu OMPIOÓ-odvodeného polypeptidu vhostiteľskej bunke, b) sekvencie afinitného čistenia, a c) akékoľvek užitočné imunogénne sekvencie(napríklad. sekvencie kódujúce jeden alebo viaceré epitopy povrchovo-exponovaného proteínu mikrobiálneho patogénu).Výhodne OMPIOÓ-odvodenými polypeptidmi podľa tohto vynálezu sú imunologicky krížovo-reaktívne s OMPI 06 polypeptidom, teda sú schopné vyvolať u živočícha imunitnú odozvu na M. catarrhalis. Výhodnejšie obsahujú OMPI 06-odvodené polypeptidy podľa tohto vynálezu sekvencie tvoriace jeden alebo viaceré vonkajšie-povrchové epitopy pôvodného OMPI 06 polypeptidu M catarrhałis (t. j. povrchovo-exponované epitopy OMPI 06 polypeptidu tak, ako existuje v intaktných M. catarrhalis bunkách). Takéto výhodne OMPI 06-odvodené polypeptidy sa môžu identifikovať pomocou ich schopnosti špecificky viazat protilátky vyvolané intaktnými M. catarrhalis bunkamí (napríklad protilátky vyvolané formaldehydom alebo glutaldehydom viazanými M. catarrhalís bunkami takéto protilátky sa označujú vtomto dokumente ako protilátky proti celej bunke). Napríklad polypeptidy alebo peptídy zobmedzenej alebo úplnej proteázovej digescie OMPI 06 polypeptidu sa frakcionizujú s použitím štandardných spôsobov a testujú na ich schopnosti viazať protilátky proti celej bunke. Reaktívne polypeptidy obsahujú výhodné OMPlOÓ-odvodené polypeptidy. Tieto sa izolujú a ich aminokyselinové sekvencie sa určia pomocou spôsobov známych v tomto odbore.OMPI 06-odvodené polypeptidy podľa tohto vynálezu tiež výhodne obsahujú sekvencie, ktore tvoria jeden alebo viaceré epitopy pôvodného OMP 106 polypeptidu, ktoré sprostredkujú hemaglutináciu s HA M. catarrbalis bunkami. Takéto výhodné OMPI 06-odvodené polypeptidy môžu byť identifikovane podľa ich schopnosti interferovat s hemaglutináciou s HA M. catarrhalis bunkamí. Napriklad polypeptidy z obmedzenej alebo úplnej proteázovej digescie alebo chemického štiepenia OMPI 06 polypeptidu sa frakcionizujú s použitím štandardných spôsobov a testujú sa na schopnosti interferovat pri hemaglutinácii s M. catarrhalis bunkamí. Už identifikované a izolované aminokyselinové sekvencie takýchto výhodných OMPI 06-odvodených polypeptidov sa určili s použitím štandardných spôsobov sekvenovania. Určená sekvencia môže byt použitá na to, aby sa mohli vyrábať takéto polypeptidy pomocou metód chemickej syntézy a/alebo genetického inžinierstva.Tieto výhodné OMPI 06-odvodené polypeptidy sa tiež môžu identifikovať s použitím protilátok proti celej bunke, čím sa robí skríning bakteriálnych knižníc prejavujúce náhodné fragmenty M. catarrhalis genomickej DNA alebo klonované nukleotidové sekvencie kódujúce OMPI 06 polypeptid. Pozri napriklad Sambrook a spol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydanie, Cold Spring Harbor Press, NY, Diel 1, Kapitola 12. Zistia sa realttívne klony a ich inzerty sa izolujú a sekvencujú, aby sa určili aminokyselinové sekvencie takýchto výhodných OMPI 06-odvodených polypeptídov.Vynález poskytuje izolované OMPI 06 polypeptidy a 0 MP 106-odvodené polypeptidy. V tomto dokumente sa používa výraz izolované vo význame, že produkt je význarnne bez iných biologických materiálov, s ktorými je prirodzene spojený. Teda to je napríklad izolovaná OMPI 06 polypeptidová zmes, ktorá má medzi okolo 70 hmotnostných a 94 hmotnostných čistého OMP 106 polypeptidu. Výhodne sú OMPI 06 polypeptidy a OMPlO 6-odvodenć polypeptidy podľa tohto vynálezu vyčistené. V tomto dokumente sa používa výraz čistený tak, že znamená, že produkt je v podstate bez iných biologických materiálov, s ktorými je prirodzene spojený. Teda obsahuje čistenú OMPlOG polypeptídovú zmes, ktorou je najmenej 95 hmotnostných čistého OMPlOG polypeptidu, výhodne najmenej 98 hmotnostných čistého OMPI 06 polypeptidu, a najvýhodnejšie najmenej 99 hmotnostných čistého OMP 06 polypeptidu.OMPI 06 polypeptid podľa tohto vynálezu môže byt izolovaný z proteinových extraktov, vrátane celobunkového extraktu niektorého M. catarrhalis kmeňa alebo kultivaru. Výhodne je proteínovým extraktom oktylglukozidový alebo sarkozylový extrakt vonkajších membrán mechúrikov(t. j., pľuzgierikov) alebo celých buniek M catarrhalis vrátane, ale bez obmedzenia na ne, niektorých kmeňov ATCC 49143, ATCC 25238, ATCC 25240, ATCC 43617,ATCC 43618, ATCC 43627 a ATCC 43628. Výhodný zdroj takýchto extraktov je HA kultivar takýchto kmeňov. Výhodnejším zdrojom takýchto extraktov je HA kultivar ATCC 49143. Ďalším zdrojom OMPI 06 polypeptidu je proteínový preparát zo systémov génovej expresie prejavujúcej klonované sekvencie kódujúce OMPI 06 polypeptid alebo OMPI 06-odvodené polypeptidy (pozri odsek 8.,v tomto dokumente).OMPI 06 polypeptid sa môže izolovať a čistiť od zdrojového materiálu s použitím niektorej biochemíckej techniky a prístupom dobre známym odbomíkom v tejto oblasti. Pri jednom pristupe sa M. catarrhalis vonkajšie membrány získajú pomocou štandardnej techniky a vonkajšie membránové proteíny sa solubilizujú s použitím solubilizačnej látky, ako je napríklad detergent. Výhodným solubilizačným roztokom je roztok obsahujúci okolo 1,25 hmotnJobj. oktyl-glukopyranozidu (OG), Ďalším výhodným solubilízačným roztokom je roztok obsahujúci okolo 1,25 hmotnostného sarkozylu. OMPI 06 polypeptid je v solubilizovanom podiele. Bunkové zlomky a nerozpusmý materiál v extrakte sa sepamjú a odstránia výhodne pomocou centrifugácie. Polypeptidy v extrakte sa skoncentrujú,inkubujú v SDS-obsahujúcom Laemmli gélovom pufri pri 100 °C počas 5 minút a potom sa frakcionizujú pomocou elektroforézy v 6 hmotnostných denaturujúcom sodnom dodecylsulfát (SDS) polyakrylamidovom géli (PAG) bez redukčného činidla. Pozri Laemmli, 1970, Nature 227 680 až 685. Pás alebo frakcia identífikovaná ako OMPI 06 po

MPK / Značky

MPK: C12N 15/31, C07K 16/12, A61K 39/40, C12Q 1/68, C07K 14/22, A61K 39/095

Značky: polypeptid, izolovaná, prostriedok, fragment, obsahom, protilátka, omp106, použitie, antigénový, vakcína, izolovaný

Odkaz

<a href="http://skpatents.com/29-284812-izolovany-omp106-polypeptid-alebo-jeho-fragment-vakcina-a-antigenovy-prostriedok-s-ich-obsahom-izolovana-dna-izolovana-protilatka-a-ich-pouzitie.html" rel="bookmark" title="Databáza patentov Slovenska">Izolovaný OMP106 polypeptid alebo jeho fragment, vakcína a antigénový prostriedok s ich obsahom, izolovaná DNA, izolovaná protilátka a ich použitie</a>

Podobne patenty